Diferencijalna dijagnoza plućnih nodula identificiranih kompjutoriziranom tomografijom (CT) ostaje izazov u kliničkoj praksi.Ovdje karakteriziramo globalni metabolom 480 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrole, benigne plućne čvorove i stadij I adenokarcinoma pluća.Adenokarcinomi pokazuju jedinstvene metabolomske profile, dok benigni čvorovi i zdravi pojedinci imaju veliku sličnost u metabolomičkim profilima.U skupini otkrića (n = 306), identificiran je skup od 27 metabolita za razlikovanje benignih od malignih čvorova.AUC diskriminantnog modela u skupinama za unutarnju (n = 104) i vanjsku validaciju (n = 111) bio je 0,915 odnosno 0,945.Analiza puta otkrila je povećane glikolitičke metabolite povezane sa smanjenim triptofanom u serumu adenokarcinoma pluća u usporedbi s benignim čvorovima i zdravim kontrolama, te sugerira da unos triptofana potiče glikolizu u stanicama raka pluća.Naša studija naglašava vrijednost biomarkera metabolita u serumu u procjeni rizika od plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Rana dijagnoza je ključna za poboljšanje stope preživljavanja pacijenata oboljelih od raka.Rezultati američkog nacionalnog ispitivanja raka pluća (NLST) i europske NELSON studije pokazali su da probir s niskom dozom kompjutorizirane tomografije (LDCT) može značajno smanjiti smrtnost od raka pluća u visokorizičnim skupinama1,2,3.Od raširene upotrebe LDCT-a za probir raka pluća, učestalost slučajnih radiografskih nalaza asimptomatskih plućnih čvorova nastavila je rasti 4 .Plućni noduli se definiraju kao žarišna zamućenja do 3 cm u promjeru 5 .Suočavamo se s poteškoćama u procjeni vjerojatnosti zloćudnosti i suočavanju s velikim brojem plućnih čvorova otkrivenih slučajno na LDCT-u.Ograničenja CT-a mogu dovesti do čestih kontrolnih pregleda i lažno pozitivnih rezultata, što dovodi do nepotrebne intervencije i pretjeranog liječenja6.Stoga postoji potreba za razvojem pouzdanih i korisnih biomarkera za ispravnu identifikaciju raka pluća u ranim stadijima i razlikovanje većine benignih čvorova pri početnom otkrivanju 7 .
Sveobuhvatna molekularna analiza krvi (seruma, plazme, mononuklearnih stanica periferne krvi), uključujući genomiku, proteomiku ili metilaciju DNA8,9,10, dovela je do rastućeg interesa za otkriće dijagnostičkih biomarkera za rak pluća.U međuvremenu, metabolomički pristupi mjere stanične krajnje proizvode koji su pod utjecajem endogenih i egzogenih djelovanja i stoga se primjenjuju za predviđanje početka i ishoda bolesti.Tekućinska kromatografija-tandemska spektrometrija mase (LC-MS) široko je korištena metoda za proučavanje metabolomike zbog svoje visoke osjetljivosti i velikog dinamičkog raspona, koji može pokriti metabolite s različitim fizikalno-kemijskim svojstvima11,12,13.Iako je globalna metabolomička analiza plazme/seruma korištena za identifikaciju biomarkera povezanih s dijagnozom raka pluća14,15,16,17 i učinkovitosti liječenja,18 klasifikatore metabolita u serumu za razlikovanje benignih i malignih plućnih nodula još treba dosta proučiti.- masovno istraživanje.
Adenokarcinom i karcinom skvamoznih stanica dva su glavna podtipa raka pluća nemalih stanica (NSCLC).Razni CT probirni testovi pokazuju da je adenokarcinom najčešći histološki tip raka pluća1,19,20,21.U ovoj smo studiji koristili tekućinsku kromatografiju ultraučinkovite masene spektrometrije visoke razlučivosti (UPLC-HRMS) za izvođenje metabolomičke analize na ukupno 695 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrole, benigne plućne čvorove i CT-om otkrivene ≤3 cm.Probir za stadij I adenokarcinoma pluća.Identificirali smo skup serumskih metabolita koji razlikuju adenokarcinom pluća od benignih čvorova i zdravih kontrola.Analiza obogaćivanja puta otkrila je da su abnormalni metabolizam triptofana i glukoze uobičajene promjene kod adenokarcinoma pluća u usporedbi s benignim čvorovima i zdravim kontrolama.Konačno, uspostavili smo i potvrdili serumski metabolički klasifikator visoke specifičnosti i osjetljivosti za razlikovanje malignih i benignih plućnih čvorova otkrivenih LDCT-om, što može pomoći u ranoj diferencijalnoj dijagnozi i procjeni rizika.
U trenutnoj studiji, uzorci seruma koji odgovaraju spolu i dobi retrospektivno su prikupljeni od 174 zdrave kontrole, 292 bolesnika s benignim plućnim čvorovima i 229 bolesnika s adenokarcinomom pluća I. stadija.Demografske karakteristike 695 ispitanika prikazane su u dodatnoj tablici 1.
Kao što je prikazano na slici 1a, ukupno 480 uzoraka seruma, uključujući 174 zdrava kontrola (HC), 170 benignih čvorova (BN) i 136 uzoraka adenokarcinoma pluća (LA) stadija I, prikupljeno je u Centru za rak Sveučilišta Sun Yat-sen.Kohorta otkrića za neciljano metabolomsko profiliranje pomoću tekućinske kromatografije ultraučinkovitosti - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 1, identificirani su različiti metaboliti između LA i HC, LA i BN kako bi se uspostavio model klasifikacije i dodatno istražila analiza diferencijalnog puta.104 uzorka koje je prikupio Centar za rak Sveučilišta Sun Yat-sen i 111 uzoraka koje su prikupile dvije druge bolnice podvrgnuto je unutarnjoj odnosno vanjskoj validaciji.
Populacija u ispitivanju u kohorti otkrića koja je podvrgnuta globalnoj metabolomičkoj analizi seruma korištenjem tekućinske kromatografije ultraučinkovite masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).b Diskriminantna analiza djelomičnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) ukupnog metaboloma 480 uzoraka seruma iz kohorte studije, uključujući zdrave kontrole (HC, n = 174), benigne čvorove (BN, n = 170) i stadij I adenokarcinoma pluća (Los Angeles, n = 136).+ESI, način pozitivne ionizacije elektrosprejem, -ESI, način negativne ionizacije elektrosprejem.c–e Metaboliti sa značajno različitim količinama u dvije zadane skupine (dvostrani Wilcoxonov test rangiranja s predznakom, p vrijednost prilagođena stopi lažnog otkrivanja, FDR <0,05) prikazani su crvenom (promjena puta > 1,2) i plavom (promjena puta < 0,83) .) prikazano na grafikonu vulkana.f Toplinska mapa hijerarhijskog grupiranja koja pokazuje značajne razlike u broju označenih metabolita između LA i BN.Izvorni podaci daju se u obliku datoteka izvornih podataka.
Ukupni serumski metabolom od 174 HC, 170 BN i 136 LA u skupini otkrića analiziran je korištenjem UPLC-HRMS analize.Prvo pokazujemo da se uzorci kontrole kvalitete (QC) čvrsto grupiraju u središtu modela nenadzirane analize glavnih komponenti (PCA), potvrđujući stabilnost izvedbe trenutne studije (dodatna slika 2).
Kao što je prikazano u diskriminantnoj analizi djelomičnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) na slici 1b, otkrili smo da postoje jasne razlike između LA i BN, LA i HC u pozitivnim (+ESI) i negativnim (−ESI) načinima ionizacije elektrosprejom .izolirani.Međutim, nisu pronađene značajne razlike između BN i HC u +ESI i -ESI uvjetima.
Pronašli smo 382 diferencijalna obilježja između LA i HC, 231 diferencijalno obilježje između LA i BN i 95 diferencijalnih obilježja između BN i HC (Wilcoxonov test rangiranja s predznakom, FDR <0,05 i višestruka promjena >1,2 ili <0,83) (Slika .1c-e )..Vrhovi su dodatno označeni (dodatni podaci 3) u odnosu na bazu podataka (mzCloud/HMDB/Chemspider biblioteka) pomoću m/z vrijednosti, vremena zadržavanja i pretraživanja spektra mase fragmentacije (pojedinosti opisani u odjeljku Metode) 22 .Konačno, identificirano je 33 i 38 označenih metabolita sa značajnim razlikama u obilju za LA u odnosu na BN (Slika 1f i Dodatna tablica 2) odnosno LA u odnosu na HC (Dopunska slika 3 i Dopunska tablica 2).Nasuprot tome, samo 3 metabolita sa značajnim razlikama u obilju identificirana su u BN i HC (dodatna tablica 2), u skladu s preklapanjem između BN i HC u PLS-DA.Ovi različiti metaboliti pokrivaju širok raspon biokemikalija (dodatna slika 4).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju značajne promjene u serumskom metabolomu koje odražavaju malignu transformaciju ranog stadija raka pluća u usporedbi s benignim plućnim čvorovima ili zdravim subjektima.U međuvremenu, sličnost serumskog metaboloma BN i HC sugerira da benigni plućni čvorovi mogu dijeliti mnoge biološke karakteristike sa zdravim pojedincima.S obzirom na to da su mutacije gena receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) česte u podtipu 23 adenokarcinoma pluća, nastojali smo odrediti utjecaj pokretačkih mutacija na serumski metabolom.Zatim smo analizirali ukupni metabolomički profil 72 slučaja s EGFR statusom u skupini s adenokarcinomom pluća.Zanimljivo je da smo pronašli usporedive profile između pacijenata s EGFR mutantima (n = 41) i pacijenata s divljim tipom EGFR (n = 31) u PCA analizi (dodatna slika 5a).Međutim, identificirali smo 7 metabolita čija je zastupljenost značajno promijenjena u bolesnika s EGFR mutacijom u usporedbi s pacijentima s divljim tipom EGFR (t test, p < 0,05 i promjena puta > 1,2 ili < 0,83) (dodatna slika 5b).Većina ovih metabolita (5 od 7) su acilkarnitini, koji igraju važnu ulogu u putevima oksidacije masnih kiselina.
Kao što je prikazano u tijeku rada prikazanom na slici 2a, biomarkeri za klasifikaciju nodula dobiveni su korištenjem operatora najmanjeg apsolutnog skupljanja i odabirom na temelju 33 različita metabolita identificirana u LA (n = 136) i BN (n = 170).Najbolja kombinacija varijabli (LASSO) – binarni logistički regresijski model.Za testiranje pouzdanosti modela korištena je deseterostruka unakrsna validacija.Odabir varijable i regularizacija parametra prilagođavaju se kaznom maksimizacije vjerojatnosti s parametrom λ24.Globalna metabolomska analiza nadalje je provedena neovisno u skupinama za internu (n = 104) i vanjsku validaciju (n = 111) kako bi se testirala učinkovitost klasifikacije diskriminantnog modela.Kao rezultat toga, 27 metabolita u skupu otkrića identificirano je kao najbolji diskriminirajući model s najvećom srednjom vrijednošću AUC (Slika 2b), među kojima je 9 imalo povećanu aktivnost, a 18 smanjenu aktivnost u LA u usporedbi s BN (Slika 2c).
Tijek rada za izradu klasifikatora plućnih nodula, uključujući odabir najboljeg panela serumskih metabolita u skupu za otkrivanje korištenjem binarnog logističkog regresijskog modela putem deseterostruke unakrsne validacije i procjenu prediktivne izvedbe u internim i eksternim setovima za validaciju.b Statistika unakrsne provjere LASSO regresijskog modela za odabir metaboličkih biomarkera.Gore navedeni brojevi predstavljaju prosječan broj biomarkera odabranih na danom λ.Crvena isprekidana linija predstavlja prosječnu vrijednost AUC pri odgovarajućoj lambdi.Sive trake pogrešaka predstavljaju minimalnu i maksimalnu AUC vrijednost.Isprekidana linija označava najbolji model s 27 odabranih biomarkera.AUC, područje ispod krivulje radne karakteristike prijemnika (ROC).c Višestruke promjene 27 odabranih metabolita u skupini LA u usporedbi sa skupinom BN u skupini otkrića.Crveni stupac – aktivacija.Plavi stupac je pad.d–f Krivulje radnih karakteristika prijemnika (ROC) koje pokazuju snagu diskriminirajućeg modela temeljenog na 27 kombinacija metabolita u setovima za otkrivanje, unutarnju i vanjsku validaciju.Izvorni podaci daju se u obliku datoteka izvornih podataka.
Model predviđanja izrađen je na temelju ponderiranih koeficijenata regresije ovih 27 metabolita (dodatna tablica 3).ROC analiza temeljena na ovih 27 metabolita dala je vrijednost površine ispod krivulje (AUC) od 0,933, osjetljivost grupe otkrića bila je 0,868, a specifičnost 0,859 (slika 2d).U međuvremenu, među 38 označenih diferencijalnih metabolita između LA i HC, skup od 16 metabolita postigao je AUC od 0,902 s osjetljivošću od 0,801 i specifičnošću od 0,856 u razlikovanju LA od HC (dodatna slika 6a-c).Također su uspoređivane vrijednosti AUC-a temeljene na različitim pragovima promjene puta za različite metabolite.Otkrili smo da je model klasifikacije imao najbolje rezultate u razlikovanju između LA i BN (HC) kada je razina promjene nabora postavljena na 1,2 u odnosu na 1,5 ili 2,0 (dodatna slika 7a,b).Klasifikacijski model, temeljen na 27 skupina metabolita, dodatno je potvrđen u internim i eksternim kohortama.AUC je bio 0,915 (osjetljivost 0,867, specifičnost 0,811) za internu validaciju i 0,945 (osjetljivost 0,810, specifičnost 0,979) za vanjsku validaciju (Slika 2e, f).Za procjenu međulaboratorijske učinkovitosti, 40 uzoraka iz vanjske kohorte analizirano je u vanjskom laboratoriju kako je opisano u odjeljku Metode.Točnost klasifikacije postigla je AUC od 0,925 (dodatna slika 8).Budući da je karcinom pločastih stanica pluća (LUSC) drugi najčešći podtip karcinoma pluća nemalih stanica (NSCLC) nakon adenokarcinoma pluća (LUAD), također smo testirali potvrđenu potencijalnu korisnost metaboličkih profila.BN i 16 slučajeva LUSC.AUC diskriminacije između LUSC i BN bio je 0,776 (dodatna slika 9), što ukazuje na slabiju sposobnost u usporedbi s diskriminacijom između LUAD i BN.
Studije su pokazale da je veličina nodula na CT slikama u pozitivnoj korelaciji s vjerojatnošću malignosti i ostaje glavna odrednica liječenja nodula25,26,27.Analiza podataka iz velike kohorte NELSON studije probira pokazala je da je rizik od zloćudnosti u ispitanika s čvorovima <5 mm bio čak sličan onom u ispitanika bez čvorova 28 .Stoga je minimalna veličina koja zahtijeva redovito praćenje CT-om 5 mm, prema preporuci British Thoracic Society (BTS), i 6 mm, prema preporuci Fleischnerova društva 29 .Međutim, noduli veći od 6 mm i bez očitih benignih značajki, zvani neodređeni plućni noduli (IPN), ostaju veliki izazov u procjeni i liječenju u kliničkoj praksi30,31.Zatim smo ispitali je li veličina kvržica utjecala na metabolomičke potpise koristeći objedinjene uzorke iz skupina otkrića i internih validacijskih kohorti.Usredotočujući se na 27 validiranih biomarkera, prvo smo usporedili PCA profile HC i BN metaboloma ispod 6 mm.Otkrili smo da se većina podatkovnih točaka za HC i BN preklapa, pokazujući da su razine metabolita u serumu slične u obje skupine (slika 3a).Karte značajki u različitim rasponima veličina ostale su očuvane u BN i LA (Slika 3b, c), dok je uočeno odvajanje između malignih i benignih čvorova u rasponu od 6-20 mm (Slika 3d).Ova kohorta imala je AUC od 0,927, specifičnost od 0,868 i osjetljivost od 0,820 za predviđanje malignosti čvorova veličine 6 do 20 mm (Slika 3e, f).Naši rezultati pokazuju da klasifikator može uhvatiti metaboličke promjene uzrokovane ranom malignom transformacijom, bez obzira na veličinu čvorića.
ad Usporedba PCA profila između navedenih skupina na temelju metaboličkog klasifikatora od 27 metabolita.CC i BN < 6 mm.b BN < 6 mm u odnosu na BN 6–20 mm.u LA 6–20 mm naspram LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Krivulja radne karakteristike prijamnika (ROC) prikazuje performanse diskriminirajućeg modela za nodule 6–20 mm.f Vrijednosti vjerojatnosti izračunate su na temelju modela logističke regresije za nodule veličine 6-20 mm.Siva točkasta linija predstavlja optimalnu graničnu vrijednost (0,455).Gornji brojevi predstavljaju postotak slučajeva predviđenih za Los Angeles.Koristite dvostrani Studentov t test.PCA, analiza glavnih komponenti.AUC površina ispod krivulje.Izvorni podaci daju se u obliku datoteka izvornih podataka.
Četiri uzorka (u dobi od 44 do 61 godine) sa sličnim veličinama plućnih nodula (7-9 mm) dodatno su odabrana za ilustraciju izvedbe predloženog modela predviđanja zloćudnosti (Slika 4a, b).Na početnom pregledu, slučaj 1 predstavljen je kao čvrsti čvor s kalcifikacijom, značajkom povezanom s benignošću, dok je slučaj 2 predstavljen kao neodređeni djelomično čvrsti čvor bez očitih benignih obilježja.Tri kruga naknadnih CT pretraga pokazala su da su ti slučajevi ostali stabilni tijekom 4-godišnjeg razdoblja i stoga su se smatrali benignim nodulima (slika 4a).U usporedbi s kliničkom procjenom serijskih CT skeniranja, jednostruka analiza metabolita u serumu s trenutnim modelom klasifikatora brzo je i ispravno identificirala ove benigne čvorove na temelju probabilističkih ograničenja (Tablica 1).Na slici 4b u slučaju 3 prikazan je nodus sa znakovima pleuralne retrakcije, koji je najčešće povezan sa malignom32.Slučaj 4 prikazan je kao neodređeni djelomično čvrsti čvor bez dokaza benignog uzroka.Svi ovi slučajevi predviđeni su kao maligni prema modelu klasifikatora (Tablica 1).Procjena adenokarcinoma pluća dokazana je histopatološkim pregledom nakon operacije resekcije pluća (Slika 4b).Za skup vanjske validacije, metabolički klasifikator točno je predvidio dva slučaja neodređenih plućnih nodula većih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT slike aksijalnog prozora pluća dva slučaja benignih čvorova.U slučaju 1, CT je nakon 4 godine pokazao stabilan solidan nodus veličine 7 mm s kalcifikacijom u desnom donjem režnju.U slučaju 2, CT je nakon 5 godina otkrio stabilan, djelomično solidan nodus promjera 7 mm u desnom gornjem režnju.b CT slike pluća u aksijalnom prozoru i odgovarajuće patološke studije dvaju slučajeva adenokarcinoma stadija I prije resekcije pluća.U slučaju 3 otkriven je nodul promjera 8 mm u desnom gornjem režnju s pleuralnom retrakcijom.Slučaj 4 otkrio je djelomično čvrstu kvržicu od brušenog stakla veličine 9 mm u lijevom gornjem režnju.Bojanje hematoksilinom i eozinom (H&E) reseciranog plućnog tkiva (ljestvica = 50 μm) pokazuje acinarni obrazac rasta adenokarcinoma pluća.Strelice označavaju nodule otkrivene na CT slikama.H&E slike su reprezentativne slike višestrukih (>3) mikroskopskih polja koje pregledava patolog.
Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju potencijalnu vrijednost biomarkera metabolita u serumu u diferencijalnoj dijagnozi plućnih nodula, što može predstavljati izazov pri procjeni CT probira.
Na temelju validirane ploče diferencijalnih metabolita, nastojali smo identificirati biološke korelate glavnih metaboličkih promjena.Analiza obogaćivanja KEGG puta koju je proveo MetaboAnalyst identificirala je 6 uobičajenih značajno promijenjenih putova između dvije dane skupine (LA naspram HC i LA naspram BN, prilagođeni p ≤ 0,001, učinak > 0,01).Te promjene karakteriziraju poremećaji metabolizma piruvata, triptofana, niacina i nikotinamida, glikolize, TCA ciklusa i metabolizma purina (Slika 5a).Zatim smo dodatno izvršili ciljanu metabolomiku kako bismo potvrdili velike promjene koristeći apsolutnu kvantifikaciju.Određivanje uobičajenih metabolita u uobičajeno promijenjenim putevima trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometrijom (QQQ) korištenjem autentičnih standarda metabolita.Demografske karakteristike ciljnog uzorka metabolomičke studije uključene su u dodatnu tablicu 4. U skladu s našim globalnim metabolomskim rezultatima, kvantitativna analiza potvrdila je da su hipoksantin i ksantin, piruvat i laktat povećani u LA u usporedbi s BN i HC (Slika 5b, c, p <0,05).Međutim, nisu pronađene značajne razlike u ovim metabolitima između BN i HC.
Analiza obogaćenja KEGG puta značajno različitih metabolita u LA skupini u usporedbi s BN i HC skupinama.Korišten je dvosmjerni Globaltest, a p vrijednosti su prilagođene Holm-Bonferroni metodom (prilagođeni p ≤ 0,001 i veličina učinka > 0,01).b–d Violin grafikoni koji pokazuju razine hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata i triptofana u serumu HC, BN i LA određene pomoću LC-MS/MS (n = 70 po skupini).Bijele i crne isprekidane linije označavaju medijan odnosno kvartil.e Violin dijagram koji prikazuje normaliziranu ekspresiju mRNA Log2TPM (transkripata na milijun) SLC7A5 i QPRT u adenokarcinomu pluća (n = 513) u usporedbi s normalnim plućnim tkivom (n = 59) u skupu podataka LUAD-TCGA.Bijeli okvir predstavlja interkvartilni raspon, vodoravna crna linija u sredini predstavlja medijan, a okomita crna linija koja se proteže od okvira predstavlja 95% interval pouzdanosti (CI).f Pearsonov dijagram korelacije ekspresije SLC7A5 i GAPDH u adenokarcinomu pluća (n = 513) i normalnom plućnom tkivu (n = 59) u skupu podataka TCGA.Sivo područje predstavlja 95% CI.r, Pearsonov koeficijent korelacije.g Normalizirane stanične razine triptofana u stanicama A549 transficiranim nespecifičnom shRNA kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) utvrđene pomoću LC-MS/MS.Prikazana je statistička analiza pet biološki neovisnih uzoraka u svakoj skupini.h Stanične razine NADt (ukupni NAD, uključujući NAD+ i NADH) u A549 stanicama (NC) i SLC7A5 knockdown A549 stanicama (Sh1, Sh2).Prikazana je statistička analiza tri biološki neovisna uzorka u svakoj skupini.i Glikolitička aktivnost stanica A549 prije i nakon nokdauna SLC7A5 mjerena je brzinom ekstracelularne acidifikacije (ECAR) (n = 4 biološki neovisna uzorka po skupini).2-DG,2-deoksi-D-glukoza.U (b–h) korišten je dvostrani Studentov t test.U (g–i), stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± SD, svaki je eksperiment izveden tri puta neovisno i rezultati su bili slični.Izvorni podaci daju se u obliku datoteka izvornih podataka.
Uzimajući u obzir značajan utjecaj promijenjenog metabolizma triptofana u LA grupi, također smo procijenili razine triptofana u serumu u HC, BN i LA grupama koristeći QQQ.Otkrili smo da je serumski triptofan smanjen u LA u usporedbi s HC ili BN (p < 0,001, slika 5d), što je u skladu s prethodnim nalazima da su razine cirkulirajućeg triptofana niže u bolesnika s rakom pluća nego u zdravih kontrolnih osoba iz kontrolne skupine33,34 ,35.Druga studija koja je koristila PET/CT tragač 11C-metil-L-triptofan otkrila je da je vrijeme zadržavanja signala triptofana u tkivu raka pluća značajno povećano u usporedbi s benignim lezijama ili normalnim tkivom36.Pretpostavljamo da bi smanjenje triptofana u serumu LA moglo odražavati aktivni unos triptofana od strane stanica raka pluća.
Također je poznato da je krajnji produkt kinureninskog puta katabolizma triptofana NAD+37,38, koji je važan supstrat za reakciju gliceraldehid-3-fosfata s 1,3-bisfosfogliceratom u glikolizi39.Dok su prethodne studije bile usredotočene na ulogu katabolizma triptofana u imunološkoj regulaciji, nastojali smo razjasniti međudjelovanje između disregulacije triptofana i glikolitičkih putova promatranih u trenutnoj studiji.Poznato je da je član 5 obitelji prijenosnika otopine 7 (SLC7A5) prijenosnik triptofana 43,44,45.Fosforiboziltransferaza kinolinske kiseline (QPRT) je enzim koji se nalazi nizvodno od kinureninskog puta koji pretvara kinolinsku kiselinu u NAMN46.Inspekcija skupa podataka LUAD TCGA otkrila je da su i SLC7A5 i QPRT značajno pojačani u tumorskom tkivu u usporedbi s normalnim tkivom (Slika 5e).Ovo povećanje uočeno je u stadijima I i II, kao i stadijima III i IV adenokarcinoma pluća (dodatna slika 11), što ukazuje na rane poremećaje u metabolizmu triptofana povezane s tumorigenezom.
Uz to, skup podataka LUAD-TCGA pokazao je pozitivnu korelaciju između ekspresije mRNA SLC7A5 i GAPDH u uzorcima pacijenata oboljelih od raka (r = 0,45, p = 1,55E-26, slika 5f).Nasuprot tome, nije pronađena značajna korelacija između takvih genskih potpisa u normalnom plućnom tkivu (r = 0,25, p = 0,06, slika 5f).Obaranje SLC7A5 (dodatna slika 12) u stanicama A549 značajno je smanjilo stanične razine triptofana i NAD(H) (Slika 5g,h), što je rezultiralo oslabljenom glikolitičkom aktivnošću mjereno ekstracelularnom stopom acidifikacije (ECAR) (Slika 1).5i).Stoga, na temelju metaboličkih promjena u serumu i in vitro detekcije, pretpostavljamo da metabolizam triptofana može proizvesti NAD+ kroz kinureninski put i igrati važnu ulogu u promicanju glikolize kod raka pluća.
Studije su pokazale da veliki broj neodređenih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om može dovesti do potrebe za dodatnim testiranjem kao što je PET-CT, biopsija pluća i pretjerano liječenje zbog lažno pozitivne dijagnoze malignosti.31 Kao što je prikazano na slici 6, naša je studija identificirala skupinu serumskih metabolita s potencijalnom dijagnostičkom vrijednošću koja može poboljšati stratifikaciju rizika i naknadno liječenje plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Plućni noduli se procjenjuju pomoću kompjutorizirane tomografije s niskom dozom (LDCT) sa slikovnim značajkama koje upućuju na benigne ili zloćudne uzroke.Nesiguran ishod nodula može dovesti do čestih kontrolnih posjeta, nepotrebnih intervencija i pretjeranog liječenja.Uključivanje serumskih metaboličkih klasifikatora s dijagnostičkom vrijednošću može poboljšati procjenu rizika i kasnije liječenje plućnih čvorova.PET pozitronska emisijska tomografija.
Podaci iz američke NLST studije i europske NELSON studije sugeriraju da probir visokorizičnih skupina pomoću kompjutorizirane tomografije niske doze (LDCT) može smanjiti smrtnost od raka pluća1,3.Međutim, procjena rizika i kasnije kliničko liječenje velikog broja slučajnih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om ostaju najveći izazov.Glavni cilj je optimizirati ispravnu klasifikaciju postojećih protokola temeljenih na LDCT-u uključivanjem pouzdanih biomarkera.
Određeni molekularni biomarkeri, kao što su krvni metaboliti, identificirani su usporedbom raka pluća sa zdravim kontrolama15,17.U trenutnoj studiji usredotočili smo se na primjenu analize metabolomike seruma kako bismo razlikovali benigne i maligne plućne čvorove slučajno otkrivene LDCT-om.Usporedili smo globalni metabolom seruma zdrave kontrole (HC), uzorke benignih plućnih čvorova (BN) i stadija I adenokarcinoma pluća (LA) koristeći UPLC-HRMS analizu.Otkrili smo da HC i BN imaju slične metaboličke profile, dok je LA pokazao značajne promjene u usporedbi s HC i BN.Identificirali smo dva skupa serumskih metabolita koji razlikuju LA od HC i BN.
Trenutna shema identifikacije benignih i malignih nodula temeljena na LDCT-u uglavnom se temelji na veličini, gustoći, morfologiji i brzini rasta nodula tijekom vremena30.Prethodne studije su pokazale da je veličina čvorova usko povezana s vjerojatnošću raka pluća.Čak i u visokorizičnih pacijenata, rizik od malignosti u čvorovima <6 mm je <1%.Rizik malignosti za nodule veličine 6 do 20 mm kreće se od 8% do 64%30.Stoga Fleischner Society preporučuje granični promjer od 6 mm za rutinsko praćenje CT-om.29 Međutim, procjena rizika i liječenje neodređenih plućnih nodula (IPN) većih od 6 mm nisu adekvatno provedeni 31 .Trenutačno liječenje kongenitalne bolesti srca obično se temelji na budnom čekanju uz česte CT kontrole.
Na temelju validiranog metaboloma, prvi put smo pokazali preklapanje metabolomičkih potpisa između zdravih pojedinaca i benignih čvorova <6 mm.Biološka sličnost je u skladu s prethodnim nalazima CT-a da je rizik od malignosti za čvorove <6 mm jednako nizak kao i za subjekte bez čvorova.30 Treba napomenuti da naši rezultati također pokazuju da benigni čvorovi <6 mm i ≥6 mm imaju visoku sličnosti u metabolomičkim profilima, što sugerira da je funkcionalna definicija benigne etiologije dosljedna bez obzira na veličinu čvorića.Stoga, suvremeni dijagnostički paneli metabolita u serumu mogu pružiti jednu analizu kao test za isključivanje kada se čvorići inicijalno otkriju na CT-u i potencijalno smanjiti serijsko praćenje.U isto vrijeme, isti panel metaboličkih biomarkera razlikovao je maligne čvorove veličine ≥6 mm od benignih čvorova i dao točna predviđanja za IPN-ove slične veličine i dvosmislenih morfoloških značajki na CT slikama.Ovaj klasifikator metabolizma u serumu pokazao se dobrim u predviđanju malignosti nodula ≥6 mm s AUC od 0,927.Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da jedinstveni metabolomski potpisi u serumu mogu specifično odražavati rane metaboličke promjene izazvane tumorom i imati potencijalnu vrijednost kao prediktori rizika, neovisno o veličini čvorića.
Naime, adenokarcinom pluća (LUAD) i karcinom pločastih stanica (LUSC) glavni su tipovi karcinoma pluća nemalih stanica (NSCLC).S obzirom na to da je LUSC snažno povezan s uporabom duhana47, a LUAD je najčešća histologija slučajnih plućnih nodula otkrivenih CT probirom48, naš klasifikatorski model posebno je napravljen za uzorke adenokarcinoma stadija I.Wang i kolege također su se usredotočili na LUAD i identificirali devet lipidnih potpisa koristeći lipidomike za razlikovanje ranog stadija raka pluća od zdravih pojedinaca17.Testirali smo trenutni model klasifikatora na 16 slučajeva I. stupnja LUSC i 74 benigna čvorića i uočili nisku točnost predviđanja LUSC (AUC 0,776), što sugerira da LUAD i LUSC mogu imati vlastite metabolomske potpise.Doista, pokazalo se da se LUAD i LUSC razlikuju u etiologiji, biološkom podrijetlu i genetskim aberacijama49.Stoga bi druge vrste histologije trebale biti uključene u modele obuke za populacijsko otkrivanje raka pluća u programima probira.
Ovdje smo identificirali šest najčešće promijenjenih puteva u adenokarcinomu pluća u usporedbi sa zdravim kontrolama i benignim čvorovima.Ksantin i hipoksantin su uobičajeni metaboliti purinskog metaboličkog puta.U skladu s našim rezultatima, intermedijeri povezani s metabolizmom purina bili su značajno povećani u serumu ili tkivima pacijenata s adenokarcinomom pluća u usporedbi sa zdravim kontrolama ili pacijentima u preinvazivnom stadiju15,50.Povišene razine ksantina i hipoksantina u serumu mogu odražavati anabolizam potreban brzom proliferacijom stanica raka.Disregulacija metabolizma glukoze dobro je poznato obilježje metabolizma raka51.Ovdje smo primijetili značajno povećanje piruvata i laktata u skupini LA u usporedbi sa skupinom HC i BN, što je u skladu s prethodnim izvješćima o abnormalnostima glikolitičkog puta u profilima metaboloma u serumu pacijenata s karcinomom pluća nemalih stanica (NSCLC) i zdrave kontrole.rezultati su dosljedni52,53.
Važno je da smo uočili inverznu korelaciju između metabolizma piruvata i triptofana u serumu adenokarcinoma pluća.Razine triptofana u serumu bile su smanjene u skupini LA u usporedbi sa skupinom HC ili BN.Zanimljivo je da je prethodna velika studija koja je koristila prospektivnu kohortu otkrila da su niske razine cirkulirajućeg triptofana povezane s povećanim rizikom od raka pluća 54 .Triptofan je esencijalna aminokiselina koju u potpunosti unosimo hranom.Zaključujemo da smanjenje triptofana u serumu kod adenokarcinoma pluća može odražavati brzo smanjenje ovog metabolita.Dobro je poznato da je krajnji produkt katabolizma triptofana putem kinurenina izvor de novo sinteze NAD+.Budući da se NAD+ proizvodi prvenstveno kroz put spašavanja, važnost NAD+ u metabolizmu triptofana u zdravlju i bolesti tek treba utvrditi46.Naša analiza baze podataka TCGA pokazala je da je ekspresija triptofan transportera otopljenog transportera 7A5 (SLC7A5) bila značajno povećana u adenokarcinomu pluća u usporedbi s normalnim kontrolama i bila je u pozitivnoj korelaciji s ekspresijom glikolitičkog enzima GAPDH.Prethodne studije su se uglavnom usredotočile na ulogu katabolizma triptofana u suzbijanju antitumorskog imunološkog odgovora40,41,42.Ovdje pokazujemo da inhibicija unosa triptofana obaranjem SLC7A5 u stanicama raka pluća rezultira naknadnim smanjenjem staničnih razina NAD i popratnim slabljenjem glikolitičke aktivnosti.Ukratko, naša studija pruža biološku osnovu za promjene u metabolizmu seruma povezane s malignom transformacijom adenokarcinoma pluća.
EGFR mutacije su najčešće pokretačke mutacije u pacijenata s NSCLC.U našoj smo studiji otkrili da pacijenti s EGFR mutacijom (n = 41) imaju sveukupne metabolomske profile slične pacijentima s divljim tipom EGFR (n = 31), iako smo pronašli smanjene razine u serumu nekih pacijenata s EGFR mutantima kod pacijenata s acilkarnitinom.Utvrđena funkcija acilkarnitina je prijenos acilnih skupina iz citoplazme u matriks mitohondrija, što dovodi do oksidacije masnih kiselina za proizvodnju energije 55 .U skladu s našim nalazima, nedavna studija također je identificirala slične profile metaboloma između EGFR mutanta i EGFR divljeg tipa tumora analizom globalnog metaboloma 102 uzorka tkiva adenokarcinoma pluća50.Zanimljivo je da je sadržaj acilkarnitina također pronađen u skupini EGFR mutanata.Stoga, odražavaju li promjene u razinama acilkarnitina metaboličke promjene izazvane EGFR-om i temeljne molekularne putove, možda zaslužuje daljnje istraživanje.
Zaključno, naša studija uspostavlja serumski metabolički klasifikator za diferencijalnu dijagnozu plućnih čvorova i predlaže tijek rada koji može optimizirati procjenu rizika i olakšati kliničko upravljanje na temelju CT skeniranja.
Ovu studiju odobrilo je Etičko povjerenstvo bolnice za rak Sveučilišta Sun Yat-sen, Prva pridružena bolnica Sveučilišta Sun Yat-sen i Etičko povjerenstvo bolnice za rak Sveučilišta Zhengzhou.U grupama za otkrivanje i internu validaciju, 174 seruma od zdravih pojedinaca i 244 seruma od benignih čvorića prikupljeno je od pojedinaca koji su bili podvrgnuti godišnjim medicinskim pregledima na Odjelu za kontrolu i prevenciju raka, Sun Yat-sen University Cancer Center, i 166 benignih čvorića.serum.Adenokarcinomi pluća stadija I prikupljeni su iz Centra za rak Sveučilišta Sun Yat-sen.U kohorti vanjske validacije bilo je 48 slučajeva benignih čvorova, 39 slučajeva adenokarcinoma pluća I. stupnja iz Prve pridružene bolnice Sveučilišta Sun Yat-sen i 24 slučaja adenokarcinoma pluća I. stadija iz bolnice za rak u Zhengzhou.Centar za rak Sveučilišta Sun Yat-sen također je prikupio 16 slučajeva karcinoma skvamoznih stanica pluća stadija I kako bi testirao dijagnostičku sposobnost utvrđenog metaboličkog klasifikatora (karakteristike pacijenata prikazane su u Dodatnoj tablici 5).Uzorci iz kohorte za otkrivanje i kohorte za internu validaciju prikupljeni su između siječnja 2018. i svibnja 2020. Uzorci za kohortu za vanjsku validaciju prikupljeni su između kolovoza 2021. i listopada 2022. Kako bi se smanjila rodna pristranost, svakom je dodijeljen približno jednak broj muških i ženskih slučajeva kohorta.Tim za otkrivanje i Tim za interni pregled.Spol sudionika određen je na temelju vlastitog izvješća.Informirani pristanak dobiven je od svih sudionika i nije osigurana naknada.Subjekti s benignim čvorovima bili su oni sa stabilnim rezultatom CT skeniranja u razdoblju od 2 do 5 godina u vrijeme analize, osim 1 slučaja iz uzorka za vanjsku validaciju, koji je prikupljen prije operacije i dijagnosticiran histopatološkim pregledom.S izuzetkom kroničnog bronhitisa.Slučajevi adenokarcinoma pluća prikupljeni su prije resekcije pluća i potvrđeni patološkom dijagnozom.Uzorci krvi natašte sakupljeni su u epruvete za odvajanje seruma bez antikoagulansa.Uzorci krvi zgrušani su 1 sat na sobnoj temperaturi i potom centrifugirani na 2851 x g 10 minuta na 4°C da se prikupi supernatant seruma.Alikvoti seruma zamrznuti su na -80°C do ekstrakcije metabolita.Odjel za prevenciju raka i medicinski pregled Centra za rak Sveučilišta Sun Yat-sen prikupio je skup seruma od 100 zdravih darivatelja, uključujući jednak broj muškaraca i žena u dobi od 40 do 55 godina.Jednaki volumeni svakog uzorka donora su pomiješani, dobiveni pul je alikvotiran i pohranjen na -80°C.Smjesa seruma korištena je kao referentni materijal za kontrolu kvalitete i standardizaciju podataka.
Referentni serum i test uzorci su odmrznuti i metaboliti su ekstrahirani korištenjem metode kombinirane ekstrakcije (MTBE/metanol/voda) 56 .Ukratko, 50 μl seruma pomiješano je s 225 μl ledeno hladnog metanola i 750 μl ledeno hladnog metil tert-butil etera (MTBE).Promiješati smjesu i inkubirati na ledu 1 sat.Uzorci su zatim pomiješani i vrtloženo pomiješani sa 188 μl vode MS kvalitete koja je sadržavala interne standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin i 13C6-izoleucin, kupljeni od Cambridge Isotope Laboratories).Smjesa je zatim centrifugirana na 15 000 × g 10 minuta na 4 °C, a donja faza je prebačena u dvije epruvete (125 μL svaka) za LC-MS analizu u pozitivnom i negativnom načinu rada.Konačno, uzorak je isparen do suhog u vakuumskom koncentratoru velike brzine.
Osušeni metaboliti rekonstituirani su u 120 μl 80% acetonitrila, vrtloženi 5 minuta i centrifugirani na 15 000 × g 10 minuta na 4 °C.Supernatanti su prebačeni u bočice od jantarnog stakla s mikroumetcima za metabolomičke studije.Neciljana metabolomska analiza na platformi tekućinske kromatografije ultraučinkovite masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS).Metaboliti su odvojeni pomoću Dionex Ultimate 3000 UPLC sustava i ACQUITY BEH Amide kolone (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).U modu pozitivnih iona, mobilne faze su bile 95% (A) i 50% acetonitrila (B), a svaka je sadržavala 10 mmol/L amonijevog acetata i 0,1% mravlje kiseline.U negativnom načinu rada, mobilne faze A i B sadržavale su 95% odnosno 50% acetonitrila, obje faze su sadržavale 10 mmol/L amonijevog acetata, pH = 9. Program gradijenta bio je sljedeći: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12-14 min, 50-98% B;14-16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. Kolona je održavana na 40°C, a uzorak na 10°C u autosampleru.Brzina protoka bila je 0,3 ml/min, volumen injekcije 3 μl.Maseni spektrometar Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) s izvorom elektrosprejne ionizacije (ESI) radio je u načinu potpunog skeniranja i spojen s načinom praćenja ddMS2 za prikupljanje velikih količina podataka.Parametri MS postavljeni su kako slijedi: napon raspršivanja +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilare 320°C, zaštitni plin 40 arb, pomoćni plin 10 arb, temperatura grijača sonde 350°C, raspon skeniranja 70–1050 m/h, rezolucija.70 000. Podaci su prikupljeni korištenjem Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za procjenu kvalitete podataka, skupni uzorci kontrole kvalitete (QC) generirani su uklanjanjem alikvota od 10 μL supernatanta iz svakog uzorka.Šest ubrizgavanja uzoraka za kontrolu kvalitete analizirano je na početku analitičke sekvence kako bi se procijenila stabilnost UPLC-MS sustava.Uzorci za kontrolu kvalitete zatim se povremeno uvode u seriju.Svih 11 serija uzoraka seruma u ovoj studiji analizirano je LC-MS.Alikvoti mješavine skupa seruma od 100 zdravih donora korišteni su kao referentni materijal u odgovarajućim serijama za praćenje procesa ekstrakcije i prilagođavanje učinaka od serije do serije.Neciljana metabolomička analiza kohorte otkrića, kohorte za unutarnju validaciju i kohorte za vanjsku validaciju provedena je u Centru za metabolomiku Sveučilišta Sun Yat-sen.Vanjski laboratorij Centra za analizu i testiranje Tehnološkog sveučilišta Guangdong također je analizirao 40 uzoraka iz vanjske kohorte kako bi testirao izvedbu modela klasifikatora.
Nakon ekstrakcije i rekonstitucije, apsolutna kvantifikacija serumskih metabolita izmjerena je uporabom tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitosti - tandem masene spektrometrije (Agilent 6495 trostruki kvadrupol) s izvorom elektrosprejne ionizacije (ESI) u načinu rada praćenja višestruke reakcije (MRM).Za odvajanje metabolita korištena je ACQUITY BEH Amide kolona (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Mobilna faza sastojala se od 90% (A) i 5% acetonitrila (B) s 10 mmol/L amonijevog acetata i 0,1% otopine amonijaka.Program gradijenta bio je sljedeći: 0–1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Kolona je održavana na 40 °C, a uzorak na 10 °C u autosampleru.Brzina protoka bila je 0,3 mL/min, a volumen injekcije 1 μL.Parametri MS postavljeni su kako slijedi: kapilarni napon ±3,5 kV, tlak raspršivača 35 psi, protok plina omotača 12 L/min, temperatura plina omotača 350°C, temperatura plina za sušenje 250°C i protok plina za sušenje 14 l/min.MRM pretvorbe triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina i ksantina bile su 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107.9 respektivno.Podaci su prikupljeni korištenjem Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Za uzorke seruma, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin i ksantin kvantificirani su korištenjem kalibracijskih krivulja otopina standardne mješavine.Za stanične uzorke sadržaj triptofana normaliziran je na interni standard i masu staničnih proteina.
Ekstrakcija maksimuma (m/z i vrijeme zadržavanja (RT)) izvedena je korištenjem Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Kako bi se uklonile potencijalne razlike između serija, svaki karakteristični vrh testnog uzorka podijeljen je karakterističnim vrhom referentnog materijala iz iste serije kako bi se dobila relativna zastupljenost.Relativne standardne devijacije internih standarda prije i poslije standardizacije prikazane su u Dodatnoj tablici 6. Razlike između dviju skupina karakterizirane su stopom lažnog otkrivanja (FDR<0,05, Wilcoxonov test rangiranja s predznakom) i promjenom puta (>1,2 ili <0,83).Neobrađeni MS podaci ekstrahiranih značajki i MS podaci ispravljeni referentnim serumom prikazani su u Dopunskim podacima 1 odnosno Dopunskim podacima 2.Označavanje vrha provedeno je na temelju četiri definirane razine identifikacije, uključujući identificirane metabolite, navodno označene spojeve, navodno karakterizirane klase spojeva i nepoznate spojeve 22 .Na temelju pretraživanja baze podataka u Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biološki spojevi s MS/MS koji odgovaraju validiranim standardima ili napomenama točnog podudaranja u mzCloudu (rezultat > 85) ili Chemspideru konačno su odabrani kao intermedijeri između diferencijalnog metaboloma.Bilješke o vršnim vrijednostima za svaku značajku uključene su u dodatne podatke 3. MetaboAnalyst 5.0 korišten je za univarijantnu analizu obilja metabolita normaliziranog sumom.MetaboAnalyst 5.0 također je procijenio analizu obogaćenja KEGG puta na temelju značajno različitih metabolita.Analiza glavnih komponenti (PCA) i djelomična diskriminantna analiza najmanjih kvadrata (PLS-DA) analizirane su pomoću softverskog paketa ropls (v.1.26.4) s normalizacijom hrpa i automatskim skaliranjem.Optimalni model biomarkera metabolita za predviđanje malignosti nodula generiran je pomoću binarne logističke regresije s najmanjim apsolutnim skupljanjem i operatorom odabira (LASSO, R paket v.4.1-3).Učinkovitost diskriminantnog modela u skupovima za otkrivanje i validaciju karakterizirana je procjenom AUC-a na temelju ROC analize prema pROC paketu (v.1.18.0.).Optimalna granica vjerojatnosti dobivena je na temelju maksimalnog Youdenovog indeksa modela (osjetljivost + specifičnost – 1).Uzorci s vrijednostima manjim ili većim od praga bit će predviđeni kao benigni čvorovi odnosno adenokarcinom pluća.
A549 stanice (#CCL-185, American Type Culture Collection) uzgojene su u F-12K mediju koji je sadržavao 10% FBS.Kratke ukosnice RNA (shRNA) sekvence koje ciljaju SLC7A5 i neciljanu kontrolu (NC) umetnute su u lentivirusni vektor pLKO.1-puro.Antisens sekvence shSLC7A5 su sljedeće: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Protutijela na SLC7A5 (#5347) i tubulin (#2148) kupljena su od Cell Signaling Technology.Protutijela na SLC7A5 i tubulin korištena su u razrjeđenju od 1:1000 za Western blot analizu.
Seahorse XF glikolitički stres test mjeri razinu ekstracelularne acidifikacije (ECAR).U analizi su glukoza, oligomicin A i 2-DG primijenjeni uzastopno kako bi se testirao stanični glikolitički kapacitet mjeren ECAR-om.
Stanice A549 transficirane s neciljanom kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) stavljene su preko noći u posude promjera 10 cm.Stanični metaboliti ekstrahirani su s 1 ml ledeno hladnog 80% vodenog metanola.Stanice u otopini metanola su ostrugane, sakupljene u novu epruvetu i centrifugirane na 15 000 × g 15 minuta na 4 °C.Prikupite 800 µl supernatanta i osušite pomoću vakuumskog koncentratora velike brzine.Osušene pelete metabolita zatim su analizirane na razine triptofana pomoću LC-MS/MS kako je gore opisano.Stanične razine NAD(H) u stanicama A549 (NC i shSLC7A5) mjerene su pomoću kvantitativnog NAD+/NADH kolorimetrijskog kompleta (#K337, BioVision) prema uputama proizvođača.Za svaki uzorak izmjerena je razina proteina kako bi se normalizirala količina metabolita.
Za preliminarno određivanje veličine uzorka nisu korištene nikakve statističke metode.Prethodne studije metabolomike usmjerene na otkrivanje biomarkera15,18 smatrane su referentnim vrijednostima za određivanje veličine, a u usporedbi s tim izvješćima, naš je uzorak bio odgovarajući.Nijedan uzorak nije isključen iz kohorte studije.Uzorci seruma nasumično su dodijeljeni skupini za otkrivanje (306 slučajeva, 74,6%) i skupini za internu validaciju (104 slučaja, 25,4%) za neciljane metabolomske studije.Također smo nasumično odabrali 70 slučajeva iz svake skupine iz skupa otkrića za ciljane metabolomske studije.Istraživači su bili zaslijepljeni za dodjelu grupa tijekom LC-MS prikupljanja podataka i analize.Statističke analize metabolomičkih podataka i pokusi na stanicama opisani su u odgovarajućim odjeljcima Rezultati, Legende slika i Metode.Kvantifikacija staničnog triptofana, NADT-a i glikolitičke aktivnosti provedena je tri puta neovisno s identičnim rezultatima.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak izvješća o prirodnom portfelju povezan s ovim člankom.
Neobrađeni MS podaci ekstrahiranih značajki i normalizirani MS podaci referentnog seruma prikazani su u Dopunskim podacima 1 i Dopunskim podacima 2.Bilješke o vrhuncu za diferencijalne značajke predstavljene su u Dodatnim podacima 3. Skup podataka LUAD TCGA može se preuzeti s https://portal.gdc.cancer.gov/.Ulazni podaci za crtanje grafikona navedeni su u izvornim podacima.Za ovaj članak navedeni su izvorni podaci.
National Lung Screening Study Group, itd. Smanjenje smrtnosti od karcinoma pluća s niskom dozom kompjuterizirane tomografije.Sjeverna Engleska.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Probir raka pluća pomoću spiralnog CT-a s niskom dozom: rezultati Nacionalne studije probira pluća (NLST).J. Med.Zaslon 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Smanjenje smrtnosti od raka pluća volumetrijskim CT probirom u randomiziranoj studiji.Sjeverna Engleska.J. Med.382, 503–513 (2020).
Vrijeme objave: 18. rujna 2023