Diferencijalna dijagnoza plućnih nodula identificiranih kompjuteriziranom tomografijom (CT) i dalje predstavlja izazov u kliničkoj praksi. Ovdje karakteriziramo globalni metabolom 480 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrolne osobe, benigne plućne nodule i adenokarcinom pluća stadija I. Adenokarcinomi pokazuju jedinstvene metabolomske profile, dok benigni noduli i zdrave osobe imaju visoku sličnost u metabolomskim profilima. U skupini otkrića (n = 306) identificiran je skup od 27 metabolita za razlikovanje benignih i malignih nodula. AUC diskriminativnog modela u skupinama interne validacije (n = 104) i eksterne validacije (n = 111) bio je 0,915 odnosno 0,945. Analiza puta otkrila je povećane glikolitičke metabolite povezane sa smanjenim triptofanom u serumu adenokarcinoma pluća u usporedbi s benignim nodulima i zdravim kontrolnim osobama te sugerirala da unos triptofana potiče glikolizu u stanicama raka pluća. Naša studija ističe vrijednost biomarkera serumskih metabolita u procjeni rizika od plućnih nodula otkrivenih CT-om.
Rana dijagnoza ključna je za poboljšanje stope preživljavanja oboljelih od raka. Rezultati američkog Nacionalnog ispitivanja probira za rak pluća (NLST) i europske NELSON studije pokazali su da probir niskodoznom kompjuteriziranom tomografijom (LDCT) može značajno smanjiti smrtnost od raka pluća u skupinama visokog rizika1,2,3. Od široko rasprostranjene upotrebe LDCT-a za probir raka pluća, učestalost slučajnih radiografskih nalaza asimptomatskih plućnih čvorova nastavila je rasti4. Plućni čvorovi definirani su kao žarišna zasjenjenja promjera do 3 cm5. Suočavamo se s poteškoćama u procjeni vjerojatnosti maligniteta i rješavanju velikog broja plućnih čvorova slučajno otkrivenih na LDCT-u. Ograničenja CT-a mogu dovesti do čestih kontrolnih pregleda i lažno pozitivnih rezultata, što dovodi do nepotrebne intervencije i prekomjernog liječenja6. Stoga postoji potreba za razvojem pouzdanih i korisnih biomarkera za ispravnu identifikaciju raka pluća u ranim fazama i diferencijaciju većine benignih čvorova pri početnom otkrivanju7.
Sveobuhvatna molekularna analiza krvi (serum, plazma, mononuklearne stanice periferne krvi), uključujući genomiku, proteomiku ili metilaciju DNA8,9,10, dovela je do rastućeg interesa za otkriće dijagnostičkih biomarkera za rak pluća. U međuvremenu, metabolomski pristupi mjere stanične krajnje produkte na koje utječu endogeni i egzogeni postupci te se stoga primjenjuju za predviđanje početka i ishoda bolesti. Tekućinska kromatografija-tandem masena spektrometrija (LC-MS) široko je korištena metoda za metabolomske studije zbog svoje visoke osjetljivosti i velikog dinamičkog raspona, koji može pokriti metabolite s različitim fizikalno-kemijskim svojstvima11,12,13. Iako se globalna metabolomska analiza plazme/seruma koristi za identifikaciju biomarkera povezanih s dijagnozom raka pluća14,15,16,17 i učinkovitošću liječenja,18 klasifikatori serumskih metabolita za razlikovanje benignih i malignih plućnih čvorova tek trebaju biti znatno proučeni. -masovna istraživanja.
Adenokarcinom i karcinom pločastih stanica dva su glavna podtipa nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC). Različiti CT probirni testovi pokazuju da je adenokarcinom najčešći histološki tip raka pluća1,19,20,21. U ovoj studiji koristili smo ultraučinkovitu tekućinsku kromatografiju s visokorezolucijskom masenom spektrometrijom (UPLC-HRMS) za provođenje metabolomske analize na ukupno 695 uzoraka seruma, uključujući zdrave kontrolne osobe, benigne plućne nodule i CT-detektiranu veličinu ≤3 cm. Probir za adenokarcinom pluća stadija I. Identificirali smo skupinu serumskih metabolita koji razlikuju adenokarcinom pluća od benignih nodula i zdravih kontrolnih osoba. Analiza obogaćivanja signalnog puta otkrila je da su abnormalni metabolizam triptofana i glukoze uobičajene promjene u adenokarcinomu pluća u usporedbi s benignim nodulima i zdravim kontrolnim osobama. Konačno, uspostavili smo i validirali klasifikator serumskog metabolizma s visokom specifičnošću i osjetljivošću za razlikovanje malignih i benignih plućnih nodula otkrivenih LDCT-om, što može pomoći u ranoj diferencijalnoj dijagnozi i procjeni rizika.
U ovoj studiji, retrospektivno su prikupljeni uzorci seruma usklađeni prema spolu i dobi od 174 zdrave kontrolne osobe, 292 pacijenta s benignim plućnim čvorićima i 229 pacijenata s adenokarcinomom pluća stadija I. Demografske karakteristike 695 ispitanika prikazane su u Dodatnoj tablici 1.
Kao što je prikazano na slici 1a, ukupno 480 uzoraka seruma, uključujući 174 zdrave kontrolne osobe (HC), 170 benignih čvorova (BN) i 136 uzoraka adenokarcinoma pluća (LA) stadija I, prikupljeno je u Onkološkom centru Sveučilišta Sun Yat-sen. Kohorta za otkrivanje neciljanog metabolomskog profiliranja korištenjem ultra-učinkovite tekućinske kromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). Kao što je prikazano na dodatnoj slici 1, identificirani su diferencijalni metaboliti između LA i HC, LA i BN kako bi se uspostavio klasifikacijski model i dalje istražila analiza diferencijalnih putova. 104 uzorka koje je prikupio Onkološki centar Sveučilišta Sun Yat-sen i 111 uzoraka koje su prikupile dvije druge bolnice podvrgnuti su internoj, odnosno eksternoj validaciji.
a Populacija studije u kohorti otkrića koja je podvrgnuta globalnoj analizi metabolomike seruma korištenjem ultra-učinkovite tekućinske kromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). b Diskriminantna analiza parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) ukupnog metaboloma 480 uzoraka seruma iz kohorte studije, uključujući zdrave kontrole (HC, n = 174), benigne nodule (BN, n = 170) i adenokarcinom pluća stadija I (Los Angeles, n = 136). +ESI, način pozitivne ionizacije elektrosprejem, -ESI, način negativne ionizacije elektrosprejem. c–e Metaboliti sa značajno različitom abundancijom u dvije dane skupine (dvostrani Wilcoxonov test predznačenih rangova, p-vrijednost prilagođena stopi lažnog otkrića, FDR <0,05) prikazani su crvenom (promjena nagiba > 1,2) i plavom bojom (promjena nagiba < 0,83). ) prikazano na grafici vulkana. f Hijerarhijska toplinska karta klasteriranja koja prikazuje značajne razlike u broju označenih metabolita između LA i BN. Izvorni podaci se daju u obliku izvornih datoteka.
Ukupni serumski metabolom 174 HC, 170 BN i 136 LA u skupini otkrića analiziran je pomoću UPLC-HRMS analize. Prvo pokazujemo da se uzorci kontrole kvalitete (QC) čvrsto grupiraju u središtu modela nenadzirane analize glavnih komponenti (PCA), što potvrđuje stabilnost učinka trenutne studije (Dodatna slika 2).
Kao što je prikazano u parcijalnoj analizi najmanjih kvadrata s diskriminantnom analizom (PLS-DA) na slici 1b, otkrili smo da postoje jasne razlike između LA i BN, LA i HC u pozitivnom (+ESI) i negativnom (−ESI) modu elektrosprejne ionizacije. Međutim, nisu pronađene značajne razlike između BN i HC u +ESI i -ESI uvjetima.
Pronašli smo 382 diferencijalne značajke između LA i HC, 231 diferencijalnu značajku između LA i BN te 95 diferencijalnih značajki između BN i HC (Wilcoxonov test predznačenih rangova, FDR <0,05 i višestruke promjene >1,2 ili <0,83) (Slika .1c-e). Vrhovi su dodatno označeni (Dodatni podaci 3) u odnosu na bazu podataka (biblioteka mzCloud/HMDB/Chemspider) prema m/z vrijednosti, vremenu zadržavanja i pretraživanju masenog spektra fragmentacije (detalji opisani u odjeljku Metode) 22. Konačno, identificirano je 33 i 38 označenih metabolita sa značajnim razlikama u brojnosti za LA u odnosu na BN (Slika 1f i Dodatna tablica 2) odnosno LA u odnosu na HC (Dodatna slika 3 i Dodatna tablica 2). Nasuprot tome, u BN i HC identificirana su samo 3 metabolita sa značajnim razlikama u brojnosti (Dodatna tablica 2), što je u skladu s preklapanjem između BN i HC u PLS-DA. Ovi diferencijalni metaboliti pokrivaju širok raspon biokemijskih svojstava (Dodatna slika 4). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju značajne promjene u serumskom metabolomu koje odražavaju malignu transformaciju raka pluća u ranom stadiju u usporedbi s benignim plućnim čvorićima ili zdravim ispitanicima. U međuvremenu, sličnost serumskog metaboloma BN i HC sugerira da benigni plućni čvorići mogu dijeliti mnoge biološke karakteristike sa zdravim osobama. S obzirom na to da su mutacije gena receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) česte kod adenokarcinoma pluća podtipa 23, nastojali smo utvrditi utjecaj mutacija pokretača na serumski metabolom. Zatim smo analizirali ukupni metabolomski profil 72 slučaja s EGFR statusom u skupini adenokarcinoma pluća. Zanimljivo je da smo u PCA analizi pronašli usporedive profile između pacijenata s mutiranim EGFR-om (n = 41) i pacijenata s divljim tipom EGFR-a (n = 31) (Dodatna slika 5a). Međutim, identificirali smo 7 metabolita čija je zastupljenost značajno promijenjena kod pacijenata s mutacijom EGFR-a u usporedbi s pacijentima s divljim tipom EGFR-a (t-test, p < 0,05 i promjena struka > 1,2 ili < 0,83) (Dodatna slika 5b). Većina tih metabolita (5 od 7) su acilkarnitini, koji igraju važnu ulogu u putovima oksidacije masnih kiselina.
Kao što je prikazano u tijeku rada na slici 2a, biomarkeri za klasifikaciju nodula dobiveni su korištenjem operatora najmanjeg apsolutnog smanjenja i odabira na temelju 33 diferencijalna metabolita identificirana u LA (n = 136) i BN (n = 170). Najbolja kombinacija varijabli (LASSO) – binarni logistički regresijski model. Za testiranje pouzdanosti modela korištena je deseterostruka unakrsna validacija. Odabir varijabli i regularizacija parametara prilagođeni su kaznom maksimizacije vjerojatnosti s parametrom λ24. Globalna metabolomska analiza dodatno je provedena neovisno u skupinama interne validacije (n = 104) i eksterne validacije (n = 111) kako bi se testirala učinkovitost klasifikacije diskriminantnog modela. Kao rezultat toga, 27 metabolita u skupu za otkrivanje identificirano je kao najbolji diskriminantni model s najvećom srednjom vrijednošću AUC (slika 2b), među kojima je 9 imalo povećanu aktivnost, a 18 smanjenu aktivnost u LA u usporedbi s BN (slika 2c).
Tijek rada za izgradnju klasifikatora plućnih nodula, uključujući odabir najboljeg panela serumskih metabolita u skupu za otkrivanje pomoću binarnog logističkog regresijskog modela putem deseterostruke unakrsne validacije i procjenu prediktivne učinkovitosti u skupovima za unutarnju i vanjsku validaciju. b Statistika unakrsne validacije LASSO regresijskog modela za odabir metaboličkih biomarkera. Gore navedeni brojevi predstavljaju prosječan broj biomarkera odabranih pri danom λ. Crvena isprekidana linija predstavlja prosječnu vrijednost AUC-a pri odgovarajućoj lambda vrijednosti. Sive trake pogreške predstavljaju minimalne i maksimalne vrijednosti AUC-a. Isprekidana linija označava najbolji model s 27 odabranih biomarkera. AUC, površina ispod krivulje ROC (Receiver Operating Characteristic). c Promjene udjela 27 odabranih metabolita u LA skupini u usporedbi s BN skupinom u skupini za otkrivanje. Crveni stupac – aktivacija. Plavi stupac predstavlja pad. d–f Krivulje ROC (Receiver Operating Characteristic) koje prikazuju snagu diskriminantnog modela na temelju 27 kombinacija metabolita u skupovima za otkrivanje, unutarnju i vanjsku validaciju. Izvorni podaci daju se u obliku datoteka izvornih podataka.
Model predviđanja stvoren je na temelju ponderiranih regresijskih koeficijenata ovih 27 metabolita (Dodatna tablica 3). ROC analiza temeljena na ovih 27 metabolita dala je vrijednost površine ispod krivulje (AUC) od 0,933, osjetljivost skupine otkrića bila je 0,868, a specifičnost 0,859 (slika 2d). U međuvremenu, među 38 označenih diferencijalnih metabolita između LA i HC, skup od 16 metabolita postigao je AUC od 0,902 s osjetljivošću od 0,801 i specifičnošću od 0,856 u razlikovanju LA od HC (Dodatna slika 6a-c). Također su uspoređene vrijednosti AUC temeljene na različitim pragovima promjene nagiba za diferencijalne metabolite. Otkrili smo da je klasifikacijski model pokazao najbolje rezultate u razlikovanju između LA i BN (HC) kada je razina promjene nagiba postavljena na 1,2 u odnosu na 1,5 ili 2,0 (Dodatna slika 7a,b). Klasifikacijski model, temeljen na 27 skupina metabolita, dodatno je validiran u internim i eksternim kohortama. AUC je bio 0,915 (osjetljivost 0,867, specifičnost 0,811) za internu validaciju i 0,945 (osjetljivost 0,810, specifičnost 0,979) za eksternu validaciju (slika 2e, f). Kako bi se procijenila međulaboratorijska učinkovitost, 40 uzoraka iz vanjske kohorte analizirano je u vanjskom laboratoriju kako je opisano u odjeljku Metode. Točnost klasifikacije postigla je AUC od 0,925 (Dodatna slika 8). Budući da je karcinom pločastih stanica pluća (LUSC) drugi najčešći podtip nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC) nakon adenokarcinoma pluća (LUAD), testirali smo i validiranu potencijalnu korisnost metaboličkih profila. BN i 16 slučajeva LUSC-a. AUC razlikovanja između LUSC-a i BN bio je 0,776 (Dodatna slika 9), što ukazuje na slabiju sposobnost u usporedbi s razlikovanjem između LUAD-a i BN.
Studije su pokazale da veličina nodula na CT slikama pozitivno korelira s vjerojatnošću maligniteta i ostaje glavni faktor liječenja nodula25,26,27. Analiza podataka iz velike kohorte NELSON studije probira pokazala je da je rizik od maligniteta kod ispitanika s čvorovima <5 mm bio čak sličan onome kod ispitanika bez čvorova28. Stoga je minimalna veličina koja zahtijeva redovito CT praćenje 5 mm, kako preporučuje Britansko torakalno društvo (BTS), i 6 mm, kako preporučuje Fleischnerovo društvo29. Međutim, noduli veći od 6 mm i bez očitih benignih značajki, nazvani neodređeni plućni noduli (IPN), ostaju glavni izazov u procjeni i liječenju u kliničkoj praksi30,31. Zatim smo ispitali utječe li veličina nodula na metabolomske potpise koristeći združene uzorke iz kohorti za otkrivanje i internu validaciju. Fokusirajući se na 27 validiranih biomarkera, prvo smo usporedili PCA profile metaboloma HC i BN ispod 6 mm. Otkrili smo da se većina podatkovnih točaka za HC i BN preklapa, što pokazuje da su razine metabolita u serumu bile slične u obje skupine (slika 3a). Karte značajki u različitim rasponima veličina ostale su očuvane u BN i LA (slika 3b, c), dok je uočeno razdvajanje između malignih i benignih čvorova u rasponu od 6 do 20 mm (slika 3d). Ova kohorta imala je AUC od 0,927, specifičnost od 0,868 i osjetljivost od 0,820 za predviđanje malignosti čvorova veličine od 6 do 20 mm (slika 3e, f). Naši rezultati pokazuju da klasifikator može uhvatiti metaboličke promjene uzrokovane ranom malignom transformacijom, bez obzira na veličinu čvora.
ad Usporedba PCA profila između specificiranih skupina na temelju metaboličkog klasifikatora od 27 metabolita. CC i BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. u LA 6–20 mm u odnosu na LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Krivulja ROC (Receiver Operating Characteristic) koja prikazuje performanse diskriminativnog modela za nodule 6–20 mm. f Vrijednosti vjerojatnosti izračunate su na temelju logističkog regresijskog modela za nodule veličine 6–20 mm. Siva isprekidana linija predstavlja optimalnu graničnu vrijednost (0,455). Gornji brojevi predstavljaju postotak slučajeva predviđenih za Los Angeles. Koristite dvostrani Studentov t-test. PCA, analiza glavnih komponenti. AUC površina ispod krivulje. Izvorni podaci daju se u obliku izvornih datoteka.
Četiri uzorka (u dobi od 44 do 61 godine) sa sličnim veličinama plućnih čvorova (7–9 mm) dodatno su odabrana kako bi se ilustrirala učinkovitost predloženog modela predviđanja maligniteta (slika 4a, b). Pri početnom probiru, Slučaj 1 predstavio se kao čvrsti čvor s kalcifikacijom, značajkom povezanom s benignošću, dok se Slučaj 2 predstavio kao neodređeni djelomično čvrsti čvor bez očitih benignih značajki. Tri kruga CT snimanja pokazala su da su ovi slučajevi ostali stabilni tijekom razdoblja od 4 godine te su stoga smatrani benignim čvorovima (slika 4a). U usporedbi s kliničkom procjenom serijskih CT snimanja, analiza jednokratnih metabolita seruma s trenutnim modelom klasifikacije brzo je i ispravno identificirala ove benigne čvorove na temelju vjerojatnosnih ograničenja (Tablica 1). Slika 4b u slučaju 3 prikazuje čvor sa znakovima pleuralne retrakcije, koja je najčešće povezana s malignitetom32. Slučaj 4 predstavio se kao neodređeni djelomično čvrsti čvor bez dokaza o benignom uzroku. Svi ovi slučajevi predviđeni su kao maligni prema modelu klasifikacije (Tablica 1). Procjena adenokarcinoma pluća dokazana je histopatološkim pregledom nakon operacije resekcije pluća (slika 4b). Za vanjski validacijski skup, metabolički klasifikator točno je predvidio dva slučaja neodređenih plućnih čvorova većih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT slike aksijalnog prozora pluća dva slučaja benignih čvorova. U slučaju 1, CT nakon 4 godine pokazao je stabilan čvrsti čvorić promjera 7 mm s kalcifikacijom u donjem desnom režnju. U slučaju 2, CT nakon 5 godina otkrio je stabilan, djelomično čvrsti čvorić promjera 7 mm u gornjem desnom režnju. b CT slike aksijalnog prozora pluća i odgovarajuće patološke studije dva slučaja adenokarcinoma stadija I prije resekcije pluća. Slučaj 3 otkrio je čvorić promjera 8 mm u gornjem desnom režnju s pleuralnom retrakcijom. Slučaj 4 otkrio je djelomično čvrsti čvorić u obliku matiranog stakla promjera 9 mm u gornjem lijevom režnju. Bojenje reseciranog plućnog tkiva hematoksilinom i eozinom (H&E) (skala = 50 μm) pokazuje acinarni obrazac rasta adenokarcinoma pluća. Strelice označavaju čvoriće otkrivene na CT slikama. H&E slike su reprezentativne slike višestrukih (>3) mikroskopskih polja koje je pregledao patolog.
Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju potencijalnu vrijednost biomarkera serumskih metabolita u diferencijalnoj dijagnozi plućnih nodula, što može predstavljati izazov pri procjeni CT probira.
Na temelju validiranog diferencijalnog panela metabolita, nastojali smo identificirati biološke korelate glavnih metaboličkih promjena. Analiza obogaćivanja KEGG puta pomoću MetaboAnalysta identificirala je 6 zajedničkih značajno promijenjenih putova između dvije dane skupine (LA vs. HC i LA vs. BN, prilagođeno p ≤ 0,001, učinak > 0,01). Ove promjene karakterizirali su poremećaji u metabolizmu piruvata, metabolizmu triptofana, metabolizmu niacina i nikotinamida, glikolizi, TCA ciklusu i metabolizmu purina (slika 5a). Zatim smo dodatno proveli ciljanu metabolomiku kako bismo provjerili glavne promjene korištenjem apsolutne kvantifikacije. Određivanje uobičajenih metabolita u uobičajeno promijenjenim putovima trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometrijom (QQQ) korištenjem autentičnih standarda metabolita. Demografske karakteristike ciljanog uzorka metabolomske studije uključene su u Dodatnu tablicu 4. U skladu s našim globalnim rezultatima metabolomike, kvantitativna analiza potvrdila je da su hipoksantin i ksantin, piruvat i laktat bili povećani u LA u usporedbi s BN i HC (slika 5b, c, p <0,05). Međutim, nisu pronađene značajne razlike u tim metabolitima između BN i HC.
Analiza obogaćivanja KEGG puta značajno različitih metabolita u LA skupini u usporedbi s BN i HC skupinama. Korišten je dvostrani Globaltest, a p-vrijednosti su prilagođene Holm-Bonferronijevom metodom (prilagođeni p ≤ 0,001 i veličina učinka > 0,01). b–d Violin dijagrami prikazuju razine hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata i triptofana u serumu HC, BN i LA određene LC-MS/MS (n = 70 po skupini). Bijele i crne isprekidane linije označavaju medijan, odnosno kvartil. e Violin dijagram prikazuje normaliziranu Log2TPM (transkripti na milijun) mRNA ekspresiju SLC7A5 i QPRT u adenokarcinomu pluća (n = 513) u usporedbi s normalnim tkivom pluća (n = 59) u LUAD-TCGA skupu podataka. Bijeli okvir predstavlja interkvartilni raspon, vodoravna crna linija u sredini predstavlja medijan, a okomita crna linija koja se proteže od okvira predstavlja 95% interval pouzdanosti (CI). f Pearsonov korelacijski dijagram ekspresije SLC7A5 i GAPDH u adenokarcinomu pluća (n = 513) i normalnom tkivu pluća (n = 59) u skupu podataka TCGA. Sivo područje predstavlja 95% CI. r, Pearsonov koeficijent korelacije. g Normalizirane stanične razine triptofana u stanicama A549 transficiranim nespecifičnom kontrolom shRNA (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) određenim LC-MS/MS. Prikazana je statistička analiza pet biološki neovisnih uzoraka u svakoj skupini. h Stanične razine NADt (ukupni NAD, uključujući NAD+ i NADH) u stanicama A549 (NC) i stanicama A549 s oslabljenim SLC7A5 (Sh1, Sh2). Prikazana je statistička analiza tri biološki neovisna uzorka u svakoj skupini. i Glikolitička aktivnost stanica A549 prije i nakon smanjenja ekspresije SLC7A5 mjerena je brzinom ekstracelularne acidifikacije (ECAR) (n = 4 biološki neovisna uzorka po skupini). 2-DG,2-deoksi-D-glukoza. Dvostrani Studentov t-test korišten je u (b–h). U (g–i), stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SD, svaki eksperiment proveden je tri puta neovisno i rezultati su bili slični. Izvorni podaci dani su u obliku izvornih datoteka.
Uzimajući u obzir značajan utjecaj promijenjenog metabolizma triptofana u LA skupini, također smo procijenili razine triptofana u serumu u HC, BN i LA skupinama pomoću QQQ-a. Otkrili smo da je serumski triptofan smanjen u LA u usporedbi s HC ili BN (p < 0,001, slika 5d), što je u skladu s prethodnim nalazima da su razine triptofana u cirkulaciji niže kod pacijenata s rakom pluća nego kod zdravih kontrola iz kontrolne skupine33,34,35. Druga studija koja je koristila PET/CT traser 11C-metil-L-triptofan otkrila je da je vrijeme zadržavanja signala triptofana u tkivu raka pluća značajno povećano u usporedbi s benignim lezijama ili normalnim tkivom36. Pretpostavljamo da smanjenje triptofana u serumu LA može odražavati aktivno preuzimanje triptofana od strane stanica raka pluća.
Također je poznato da je krajnji produkt kinureninskog puta katabolizma triptofana NAD+37,38, koji je važan supstrat za reakciju gliceraldehid-3-fosfata s 1,3-bisfosfogliceratom u glikolizi39. Dok su se prethodne studije usredotočile na ulogu katabolizma triptofana u imunološkoj regulaciji, nastojali smo razjasniti međudjelovanje između disregulacije triptofana i glikolitičkih putova uočenih u ovoj studiji. Poznato je da je član 5 porodice transportera otopljenih tvari 7 (SLC7A5) transporter triptofana43,44,45. Kinolinska kiselina fosforiboziltransferaza (QPRT) je enzim smješten nizvodno od kinureninskog puta koji pretvara kinolinsku kiselinu u NAMN46. Pregledom LUAD TCGA skupa podataka otkriveno je da su i SLC7A5 i QPRT značajno povišeni u tumorskom tkivu u usporedbi s normalnim tkivom (slika 5e). Ovo povećanje uočeno je u stadijima I i II, kao i u stadijima III i IV adenokarcinoma pluća (Dodatna slika 11), što ukazuje na rane poremećaje u metabolizmu triptofana povezane s tumorogenezom.
Osim toga, skup podataka LUAD-TCGA pokazao je pozitivnu korelaciju između ekspresije mRNA SLC7A5 i GAPDH u uzorcima pacijenata s rakom (r = 0,45, p = 1,55E-26, slika 5f). Nasuprot tome, nije pronađena značajna korelacija između takvih genskih potpisa u normalnom tkivu pluća (r = 0,25, p = 0,06, slika 5f). Utišavanje SLC7A5 (dodatna slika 12) u stanicama A549 značajno je smanjilo stanične razine triptofana i NAD(H) (slika 5g,h), što je rezultiralo smanjenom glikolitičkom aktivnošću mjerenom izvanstaničnom brzinom zakiseljavanja (ECAR) (slika 1). 5i). Stoga, na temelju metaboličkih promjena u serumu i in vitro detekcije, pretpostavljamo da metabolizam triptofana može proizvesti NAD+ putem kinureninskog puta i igrati važnu ulogu u promicanju glikolize u raku pluća.
Studije su pokazale da veliki broj neodređenih plućnih čvorova otkrivenih LDCT-om može dovesti do potrebe za dodatnim testiranjem poput PET-CT-a, biopsije pluća i prekomjernog liječenja zbog lažno pozitivne dijagnoze maligniteta.31 Kao što je prikazano na slici 6, naša studija identificirala je panel serumskih metabolita s potencijalnom dijagnostičkom vrijednošću koji mogu poboljšati stratifikaciju rizika i naknadno liječenje plućnih čvorova otkrivenih CT-om.
Plućni noduli se procjenjuju korištenjem kompjuterizirane tomografije niske doze (LDCT) sa slikovnim značajkama koje upućuju na benigne ili maligne uzroke. Neizvjestan ishod nodula može dovesti do čestih kontrolnih pregleda, nepotrebnih intervencija i prekomjernog liječenja. Uključivanje serumskih metaboličkih klasifikatora s dijagnostičkom vrijednošću može poboljšati procjenu rizika i naknadno liječenje plućnih nodula. PET pozitronska emisijska tomografija.
Podaci iz američke NLST studije i europske NELSON studije sugeriraju da probir visokorizičnih skupina niskodoznom kompjuteriziranom tomografijom (LDCT) može smanjiti smrtnost od raka pluća1,3. Međutim, procjena rizika i naknadno kliničko liječenje velikog broja slučajno otkrivenih plućnih čvorova LDCT-om ostaju najizazovniji. Glavni cilj je optimizirati ispravnu klasifikaciju postojećih protokola temeljenih na LDCT-u uključivanjem pouzdanih biomarkera.
Određeni molekularni biomarkeri, poput metabolita u krvi, identificirani su usporedbom raka pluća sa zdravim kontrolnim osobama15,17. U ovoj studiji usredotočili smo se na primjenu analize metabolomike seruma kako bismo razlikovali benigne i maligne plućne čvoriće slučajno otkrivene LDCT-om. Usporedili smo globalni metabolom seruma uzoraka zdrave kontrolne osobe (HC), benignih plućnih čvorića (BN) i uzoraka adenokarcinoma pluća (LA) stadija I pomoću UPLC-HRMS analize. Otkrili smo da HC i BN imaju slične metaboličke profile, dok je LA pokazao značajne promjene u usporedbi s HC i BN. Identificirali smo dva seta metabolita seruma koji razlikuju LA od HC i BN.
Trenutna shema identifikacije benignih i malignih čvorova temeljena na LDCT-u uglavnom se temelji na veličini, gustoći, morfologiji i brzini rasta čvorova tijekom vremena30. Prethodne studije pokazale su da je veličina čvorova usko povezana s vjerojatnošću raka pluća. Čak i kod pacijenata s visokim rizikom, rizik od maligniteta u čvorovima <6 mm je <1%. Rizik od maligniteta za čvorove veličine 6 do 20 mm kreće se od 8% do 64%30. Stoga Fleischnerovo društvo preporučuje granični promjer od 6 mm za rutinsko CT praćenje.29 Međutim, procjena rizika i liječenje neodređenih plućnih čvorova (IPN) većih od 6 mm nisu adekvatno provedeni31. Trenutno liječenje kongenitalnih srčanih mana obično se temelji na budnom čekanju s čestim CT praćenjem.
Na temelju validiranog metaboloma, prvi smo put pokazali preklapanje metabolomskih potpisa između zdravih osoba i benignih čvorova <6 mm. Biološka sličnost u skladu je s prethodnim CT nalazima koji su pokazali da je rizik od maligniteta za čvorove <6 mm nizak kao i za ispitanike bez čvorova.30 Treba napomenuti da naši rezultati također pokazuju da benigni čvorovi <6 mm i ≥6 mm imaju visoku sličnost u metabolomskim profilima, što sugerira da je funkcionalna definicija benigne etiologije konzistentna bez obzira na veličinu čvora. Stoga, moderni dijagnostički paneli serumskih metabolita mogu pružiti jedinstveni test kao test isključivanja kada se čvorovi početno otkriju na CT-u i potencijalno smanjiti serijsko praćenje. Istovremeno, isti panel metaboličkih biomarkera razlikovao je maligne čvorove veličine ≥6 mm od benignih čvorova i pružio točna predviđanja za IPN-ove slične veličine i dvosmislenih morfoloških značajki na CT slikama. Ovaj klasifikator serumskog metabolizma dobro se pokazao u predviđanju maligniteta čvorova ≥6 mm s AUC od 0,927. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da jedinstveni serumski metabolomski potpisi mogu specifično odražavati rane metaboličke promjene izazvane tumorom i imati potencijalnu vrijednost kao prediktori rizika, neovisno o veličini čvora.
Značajno je da su adenokarcinom pluća (LUAD) i karcinom pločastih stanica (LUSC) glavne vrste raka pluća ne-malih stanica (NSCLC). S obzirom na to da je LUSC snažno povezan s konzumacijom duhana47, a LUAD je najčešća histologija slučajno otkrivenih plućnih čvorova CT probirom48, naš model klasifikacije posebno je izgrađen za uzorke adenokarcinoma stadija I. Wang i kolege također su se usredotočili na LUAD i identificirali devet lipidnih potpisa koristeći lipidomiku kako bi razlikovali rak pluća u ranom stadiju od zdravih osoba17. Testirali smo trenutni model klasifikacije na 16 slučajeva LUSC-a stadija I i 74 benigna čvora te uočili nisku točnost predviđanja LUSC-a (AUC 0,776), što sugerira da LUAD i LUSC mogu imati vlastite metabolomske potpise. Doista, pokazalo se da se LUAD i LUSC razlikuju po etiologiji, biološkom podrijetlu i genetskim aberacijama49. Stoga bi druge vrste histologije trebale biti uključene u modele obuke za otkrivanje raka pluća na razini populacije u programima probira.
Ovdje smo identificirali šest najčešće promijenjenih puteva u adenokarcinomu pluća u usporedbi sa zdravim kontrolama i benignim nodulima. Ksantin i hipoksantin su uobičajeni metaboliti metaboličkog puta purina. U skladu s našim rezultatima, međuprodukti povezani s metabolizmom purina bili su značajno povećani u serumu ili tkivima pacijenata s adenokarcinomom pluća u usporedbi sa zdravim kontrolama ili pacijentima u preinvazivnoj fazi15,50. Povišene razine ksantina i hipoksantina u serumu mogu odražavati anabolizam potreban za brzo proliferirajuće stanice raka. Disregulacija metabolizma glukoze dobro je poznati obilježje metabolizma raka51. Ovdje smo uočili značajan porast piruvata i laktata u LA skupini u usporedbi sa HC i BN skupinom, što je u skladu s prethodnim izvješćima o abnormalnostima glikolitičkog puta u profilima metaboloma u serumu pacijenata s nemikrocelularnim karcinomom pluća (NSCLC) i zdravih kontrola. Rezultati su konzistentni52,53.
Važno je napomenuti da smo uočili inverznu korelaciju između metabolizma piruvata i triptofana u serumu adenokarcinoma pluća. Razine triptofana u serumu bile su smanjene u LA skupini u usporedbi s HC ili BN skupinom. Zanimljivo je da je prethodna velika studija koja je koristila prospektivnu kohortu otkrila da su niske razine triptofana u cirkulaciji povezane s povećanim rizikom od raka pluća 54. Triptofan je esencijalna aminokiselina koju u potpunosti dobivamo iz hrane. Zaključujemo da smanjenje razine triptofana u serumu kod adenokarcinoma pluća može odražavati brzo smanjenje razine ovog metabolita. Dobro je poznato da je krajnji produkt katabolizma triptofana putem kinureninskog puta izvor de novo sinteze NAD+. Budući da se NAD+ prvenstveno proizvodi putem puta spašavanja, važnost NAD+ u metabolizmu triptofana u zdravlju i bolesti tek treba utvrditi46. Naša analiza TCGA baze podataka pokazala je da je ekspresija transportera triptofana, transportera otopljene tvari 7A5 (SLC7A5), značajno povećana u adenokarcinomu pluća u usporedbi s normalnim kontrolama te da je pozitivno korelirala s ekspresijom glikolitičkog enzima GAPDH. Prethodne studije uglavnom su se usredotočile na ulogu katabolizma triptofana u suzbijanju antitumorskog imunološkog odgovora40,41,42. Ovdje pokazujemo da inhibicija unosa triptofana smanjenjem SLC7A5 u stanicama raka pluća rezultira naknadnim smanjenjem staničnih razina NAD-a i istodobnim slabljenjem glikolitičke aktivnosti. Ukratko, naša studija pruža biološku osnovu za promjene u metabolizmu seruma povezane s malignom transformacijom adenokarcinoma pluća.
Mutacije EGFR-a najčešće su pokretačke mutacije u bolesnika s NSCLC-om. U našoj studiji otkrili smo da su bolesnici s mutacijom EGFR-a (n = 41) imali ukupne metabolomske profile slične bolesnicima s divljim tipom EGFR-a (n = 31), iako smo pronašli smanjene serumske razine nekih pacijenata s mutiranim EGFR-om kod pacijenata s acilkarnitinom. Utvrđena funkcija acilkarnitina je transport acilnih skupina iz citoplazme u mitohondrijski matriks, što dovodi do oksidacije masnih kiselina radi proizvodnje energije 55. U skladu s našim nalazima, nedavna studija također je identificirala slične profile metaboloma između tumora s mutiranim EGFR-om i tumora s divljim tipom EGFR-a analizom globalnog metaboloma 102 uzorka tkiva adenokarcinoma pluća 50. Zanimljivo je da je sadržaj acilkarnitina pronađen i u skupini s mutiranim EGFR-om. Stoga bi moglo biti potrebno daljnje istraživanje odražavaju li promjene u razinama acilkarnitina metaboličke promjene izazvane EGFR-om i temeljne molekularne putove.
Zaključno, naša studija uspostavlja serumski metabolički klasifikator za diferencijalnu dijagnozu plućnih nodula i predlaže tijek rada koji može optimizirati procjenu rizika i olakšati kliničko liječenje na temelju CT skeniranja.
Ovu studiju odobrio je Etički odbor Onkološke bolnice Sveučilišta Sun Yat-sen, Prve pridružene bolnice Sveučilišta Sun Yat-sen i Etički odbor Onkološke bolnice Sveučilišta Zhengzhou. U skupinama za otkrivanje i internu validaciju prikupljeno je 174 seruma zdravih osoba i 244 seruma benignih čvorova od osoba koje su se podvrgavale godišnjim liječničkim pregledima u Odjelu za kontrolu i prevenciju raka, Onkološkog centra Sveučilišta Sun Yat-sen, te 166 benignih čvorova. Adenokarcinomi pluća stadija I prikupljeni su iz Onkološkog centra Sveučilišta Sun Yat-sen. U kohorti za vanjsku validaciju bilo je 48 slučajeva benignih čvorova, 39 slučajeva adenokarcinoma pluća stadija I iz Prve pridružene bolnice Sveučilišta Sun Yat-sen i 24 slučaja adenokarcinoma pluća stadija I iz Onkološke bolnice Zhengzhou. Onkološki centar Sveučilišta Sun Yat-sen također je prikupio 16 slučajeva pločastocelularnog karcinoma pluća stadija I kako bi testirao dijagnostičku sposobnost utvrđenog metaboličkog klasifikatora (karakteristike pacijenata prikazane su u Dodatnoj tablici 5). Uzorci iz kohorte za otkrivanje i interne validacije prikupljeni su između siječnja 2018. i svibnja 2020. Uzorci za vanjsku validacijsku kohortu prikupljeni su između kolovoza 2021. i listopada 2022. Kako bi se smanjila spolna pristranost, svakoj kohorti dodijeljen je približno jednak broj muških i ženskih slučajeva. Tim za otkrivanje i tim za internu reviziju. Spol sudionika određen je na temelju samoprocjene. Svi sudionici dali su informirani pristanak i nije im dana naknada. Ispitanici s benignim čvorićima bili su oni sa stabilnim rezultatom CT skeniranja u dobi od 2 do 5 godina u vrijeme analize, osim 1 slučaja iz uzorka za vanjsku validaciju, koji je prikupljen preoperativno i dijagnosticiran histopatologijom. S izuzetkom kroničnog bronhitisa. Slučajevi adenokarcinoma pluća prikupljeni su prije resekcije pluća i potvrđeni patološkom dijagnozom. Uzorci krvi natašte prikupljeni su u epruvete za odvajanje seruma bez ikakvih antikoagulansa. Uzorci krvi zgrušani su 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani na 2851 × g tijekom 10 minuta na 4°C kako bi se prikupio serumski supernatant. Alikvoti seruma zamrznuti su na -80°C do ekstrakcije metabolita. Odjel za prevenciju raka i medicinske preglede Centra za rak Sveučilišta Sun Yat-sen prikupio je skup seruma od 100 zdravih donora, uključujući jednak broj muškaraca i žena u dobi od 40 do 55 godina. Jednaki volumeni svakog uzorka donora pomiješani su, dobiveni skup je alikvotiran i pohranjen na -80°C. Smjesa seruma korištena je kao referentni materijal za kontrolu kvalitete i standardizaciju podataka.
Referentni serum i testni uzorci su odmrznuti, a metaboliti su ekstrahirani kombiniranom metodom ekstrakcije (MTBE/metanol/voda) 56. Ukratko, 50 μl seruma pomiješano je s 225 μl ledeno hladnog metanola i 750 μl ledeno hladnog metil tert-butil etera (MTBE). Smjesu je potrebno promiješati i inkubirati na ledu 1 sat. Uzorci su zatim pomiješani i vrtložno miješani sa 188 μl vode MS kvalitete koja sadrži interne standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin i 13C6-izoleucin, kupljeni od Cambridge Isotope Laboratories). Smjesa je zatim centrifugirana pri 15 000 × g tijekom 10 minuta na 4 °C, a donja faza je prenesena u dvije epruvete (po 125 μL) za LC-MS analizu u pozitivnom i negativnom načinu rada. Konačno, uzorak je uparen do suhog u brzom vakuumskom koncentratoru.
Osušeni metaboliti rekonstituirani su u 120 μl 80%-tnog acetonitrila, vrtloženi 5 minuta i centrifugirani pri 15 000 × g tijekom 10 minuta na 4 °C. Supernatanti su preneseni u jantarne staklene bočice s mikroumetcima za metabolomske studije. Neciljana metabolomska analiza provedena je na platformi ultra-učinkovite tekućinske kromatografije - masene spektrometrije visoke rezolucije (UPLC-HRMS). Metaboliti su odvojeni pomoću Dionex Ultimate 3000 UPLC sustava i ACQUITY BEH Amide kolone (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). U modu pozitivnih iona, mobilne faze bile su 95% (A) i 50% acetonitrila (B), a svaka je sadržavala 10 mmol/L amonijevog acetata i 0,1% mravlje kiseline. U negativnom načinu rada, mobilne faze A i B sadržavale su 95% odnosno 50% acetonitrila, obje faze sadržavale su 10 mmol/L amonijevog acetata, pH = 9. Gradijentni program bio je sljedeći: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Kolona je održavana na 40°C, a uzorak na 10°C u autosampleru. Brzina protoka bila je 0,3 ml/min, volumen ubrizgavanja bio je 3 μl. Q-Exactive Orbitrap maseni spektrometar (Thermo Fisher Scientific) s izvorom elektrosprejne ionizacije (ESI) radio je u načinu rada punog skeniranja i povezan s ddMS2 načinom praćenja za prikupljanje velikih količina podataka. MS parametri su postavljeni kako slijedi: napon prskanja +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilare 320 °C, zaštitni plin 40 arb, pomoćni plin 10 arb, temperatura grijača sonde 350 °C, raspon skeniranja 70–1050 m/h, rezolucija 70 000. Podaci su prikupljeni pomoću Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za procjenu kvalitete podataka, generirani su združeni uzorci kontrole kvalitete (QC) uklanjanjem alikvota od 10 μL supernatanta iz svakog uzorka. Šest injekcija uzoraka kontrole kvalitete analizirano je na početku analitičkog slijeda kako bi se procijenila stabilnost UPLC-MS sustava. Uzorci kontrole kvalitete zatim se periodički unose u seriju. Svih 11 serija uzoraka seruma u ovoj studiji analizirano je LC-MS-om. Alikvoti smjese seruma od 100 zdravih donora korišteni su kao referentni materijal u odgovarajućim serijama za praćenje procesa ekstrakcije i prilagodbu učinaka od serije do serije. Neciljana metabolomska analiza kohorte za otkrivanje, interne validacijske kohorte i eksterne validacijske kohorte provedena je u Centru za metabolomiku Sveučilišta Sun Yat-sen. Vanjski laboratorij Centra za analizu i testiranje Tehnološkog sveučilišta Guangdong također je analizirao 40 uzoraka iz vanjske kohorte kako bi testirao učinkovitost modela klasifikatora.
Nakon ekstrakcije i rekonstitucije, apsolutna kvantifikacija serumskih metabolita izmjerena je korištenjem ultra-visokoučinkovite tekućinske kromatografije-tandem masene spektrometrije (Agilent 6495 trostruki kvadrupol) s izvorom elektrosprej ionizacije (ESI) u načinu višestrukog praćenja reakcija (MRM). Za odvajanje metabolita korištena je ACQUITY BEH Amide kolona (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilna faza sastojala se od 90% (A) i 5% acetonitrila (B) s 10 mmol/L amonijevog acetata i 0,1% otopine amonijaka. Gradijentni program bio je sljedeći: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. Kolona je održavana na 40 °C, a uzorak na 10 °C u autosampleru. Brzina protoka bila je 0,3 mL/min, a volumen ubrizgavanja 1 μL. MS parametri postavljeni su kako slijedi: kapilarni napon ±3,5 kV, tlak u nebulizatoru 35 psi, protok plina plašta 12 L/min, temperatura plina plašta 350 °C, temperatura plina za sušenje 250 °C i protok plina za sušenje 14 l/min. MRM konverzije triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina i ksantina bile su 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107,9. Podaci su prikupljeni pomoću Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Za uzorke seruma, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin i ksantin kvantificirani su pomoću kalibracijskih krivulja standardnih smjesa otopina. Za uzorke stanica, sadržaj triptofana normaliziran je na interni standard i masu staničnog proteina.
Ekstrakcija vrha (m/z i vrijeme zadržavanja (RT)) provedena je pomoću Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Kako bi se uklonile potencijalne razlike između serija, svaki karakteristični vrh testiranog uzorka podijeljen je s karakterističnim vrhom referentnog materijala iz iste serije kako bi se dobila relativna abundancija. Relativne standardne devijacije internih standarda prije i nakon standardizacije prikazane su u Dodatnoj tablici 6. Razlike između dvije skupine karakterizirane su stopom lažnih otkrića (FDR<0,05, Wilcoxon test predznačenih rangova) i promjenom struka (>1,2 ili <0,83). Sirovi MS podaci ekstrahiranih značajki i referentni MS podaci korigirani za serum prikazani su u Dodatnim podacima 1 odnosno Dodatnim podacima 2. Označavanje vrhova provedeno je na temelju četiri definirane razine identifikacije, uključujući identificirane metabolite, navodno označene spojeve, navodno karakterizirane klase spojeva i nepoznate spojeve 22. Na temelju pretraživanja baze podataka u Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biološki spojevi s MS/MS podudarajućim validiranim standardima ili točnim podudaranjima u mzCloudu (rezultat > 85) ili Chemspideru konačno su odabrani kao međuprodukti između diferencijalnog metaboloma. Označke vrhova za svaku značajku uključene su u Dodatne podatke 3. MetaboAnalyst 5.0 korišten je za univarijatnu analizu količine metabolita normalizirane sumom. MetaboAnalyst 5.0 također je procijenio analizu obogaćivanja KEGG puta na temelju značajno različitih metabolita. Analiza glavnih komponenti (PCA) i diskriminantna analiza parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS-DA) analizirane su pomoću softverskog paketa ropls (v.1.26.4) s normalizacijom slaganja i automatskim skaliranjem. Optimalni model biomarkera metabolita za predviđanje maligniteta nodula generiran je pomoću binarne logističke regresije s najmanjim apsolutnim smanjenjem i operatorom odabira (LASSO, R paket v.4.1-3). Performanse diskriminantnog modela u skupovima za detekciju i validaciju karakterizirane su procjenom AUC-a na temelju ROC analize prema pROC paketu (v.1.18.0.). Optimalna granica vjerojatnosti dobivena je na temelju maksimalnog Youdenovog indeksa modela (osjetljivost + specifičnost – 1). Uzorci s vrijednostima manjim ili većim od praga bit će predviđeni kao benigni čvorići, odnosno adenokarcinom pluća.
Stanice A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) uzgajane su u F-12K mediju koji sadrži 10% FBS-a. Sekvence kratke ukosnice RNA (shRNA) usmjerene na SLC7A5 i neciljanu kontrolu (NC) umetnute su u lentivirusni vektor pLKO.1-puro. Antisense sekvence shSLC7A5 su sljedeće: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antitijela na SLC7A5 (#5347) i tubulin (#2148) kupljena su od Cell Signaling Technology. Antitijela na SLC7A5 i tubulin korištena su u razrjeđenju 1:1000 za Western blot analizu.
Seahorse XF test glikolitičkog stresa mjeri razinu izvanstanične acidifikacije (ECAR). U testu su glukoza, oligomicin A i 2-DG primijenjeni sekvencijalno kako bi se testirao stanični glikolitički kapacitet mjeren ECAR-om.
Stanice A549 transficirane s neciljanom kontrolom (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) nasađene su preko noći u posudice promjera 10 cm. Stanični metaboliti ekstrahirani su s 1 ml ledeno hladne 80%-tne vodene otopine metanola. Stanice u otopini metanola sastrugane su, sakupljene u novu epruvetu i centrifugirane pri 15 000 × g tijekom 15 minuta na 4 °C. Sakupite 800 µl supernatanta i osušite pomoću brzog vakuumskog koncentratora. Osušene pelete metabolita zatim su analizirane na razinu triptofana pomoću LC-MS/MS kao što je gore opisano. Stanične razine NAD(H) u stanicama A549 (NC i shSLC7A5) izmjerene su pomoću kvantitativnog kolorimetrijskog kompleta NAD+/NADH (#K337, BioVision) prema uputama proizvođača. Razine proteina izmjerene su za svaki uzorak kako bi se normalizirala količina metabolita.
Za preliminarno određivanje veličine uzorka nisu korištene statističke metode. Prethodne metabolomske studije usmjerene na otkrivanje biomarkera15,18 smatrane su referentnim vrijednostima za određivanje veličine, a u usporedbi s tim izvješćima, naš uzorak je bio adekvatan. Nijedan uzorak nije isključen iz studijske kohorte. Uzorci seruma nasumično su dodijeljeni skupini za otkrivanje (306 slučajeva, 74,6%) i internoj validacijskoj skupini (104 slučaja, 25,4%) za neciljane metabolomske studije. Također smo nasumično odabrali 70 slučajeva iz svake skupine iz skupa za otkrivanje za ciljane metabolomske studije. Istraživači nisu bili upoznati s raspodjelom u skupine tijekom prikupljanja i analize podataka LC-MS. Statističke analize metabolomskih podataka i staničnih eksperimenata opisane su u odgovarajućim odjeljcima Rezultati, Legende slika i Metode. Kvantifikacija stanične triptofana, NADT-a i glikolitičke aktivnosti provedena je tri puta neovisno s identičnim rezultatima.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak izvješća o prirodnom portfelju povezan s ovim člankom.
Sirovi MS podaci ekstrahiranih značajki i normalizirani MS podaci referentnog seruma prikazani su u Dodatnim podacima 1 i Dodatnim podacima 2. Oznake vrhova za diferencijalne značajke prikazane su u Dodatnim podacima 3. Skup podataka LUAD TCGA može se preuzeti s https://portal.gdc.cancer.gov/. Ulazni podaci za crtanje grafa navedeni su u izvornim podacima. Izvorni podaci navedeni su za ovaj članak.
Nacionalna studijska skupina za probir pluća itd. Smanjenje smrtnosti od raka pluća kompjuteriziranom tomografijom niskih doza. Sjeverna Engleska. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Probir raka pluća korištenjem niskodoznog spiralnog CT-a: rezultati Nacionalne studije probira pluća (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ i dr. Smanjenje smrtnosti od raka pluća volumetrijskim CT probirom u randomiziranom ispitivanju. Sjeverna Engleska. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Vrijeme objave: 18. rujna 2023.