Klasterirana regularno isprepletena kratka palindromska ponavljanja (CRISPR) su tehnika uređivanja genoma treće generacije koja je revolucionirala svijet svojim visokopropusnim rezultatima. Koristi se za liječenje raznih bioloških bolesti i infekcija. Razne bakterije i drugi prokarioti (poput arheja) također imaju CRISPR/Cas9 sustave za obranu od faga. Izviješteno je da strategije temeljene na CRISPR/Cas9 mogu inhibirati rast i napredovanje trostruko negativnog raka dojke (TNBC) ciljajući potencijalno promijenjene gene otpornosti, transkripciju i epigenetsku regulaciju. Ove terapijske intervencije mogu pomoći u rješavanju izazovnih problema poput otpornosti na lijekove koja se opaža čak i kod TNBC-a. Trenutno se koriste različite metode za isporuku CRISPR/Cas9 ciljnim stanicama, kao što su fizičke (mikroinjekcija, elektroporacija i hidrodinamički načini), virusne (adeno-povezani virus i lentivirus) i nevirusne (liposomi i lipidne nanočestice). Iako su razvijeni različiti modeli za proučavanje molekularnih uzroka TNBC-a, nedostatak osjetljivih i ciljanih metoda za isporuku alata za uređivanje genoma in vivo ograničava njihovu kliničku primjenu. Ukratko, ovaj pregled sveobuhvatno ispituje napredak, izazove, ograničenja i perspektive CRISPR/Cas9 liječenja TNBC-a na temelju postojećih dokaza. Također ističemo kako kombinacija umjetne inteligencije i strojnog učenja može poboljšati CRISPR/Cas9 strategije u liječenju TNBC-a.
Rak karakterizira nekontrolirana dioba stanica, poremećaj kontrolnih točaka staničnog ciklusa i mutacije u genima tumor supresora (TSG) (Matthews i sur., 2022.). Među različitim vrstama raka, rak dojke je najčešći tip raka kod žena i ima visoku stopu smrtnosti u cijelom svijetu (Waks i Winer, 2019.). Rak dojke je heterogena bolest s različitim karakteristikama, kao što su histološke i biološke značajke, klinička slika i ponašanje te odgovor na liječenje (Weigelt i sur., 2010.). Klasifikacija raka dojke pruža precizan uvid u dijagnozu raka dojke i prognozu tumora. Korištenje uobičajenih biomarkera i kliničkopatoloških značajki glavni je kriterij za klasifikaciju raka dojke (Tsang i Tse, 2019.). Na prognozu i odgovor na liječenje raka dojke utječu brojni čimbenici, uključujući prisutnost estrogenskog receptora (ER), progesteronskog receptora (PR), receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2/neu) te histološki stupanj, vrstu i stupanj tumora, veličinu i metastaze u limfnim čvorovima (Al-Tubaiti, 2020.). Identificirano je pet intrinzičnih molekularnih podtipova raka dojke, uključujući luminalni A, luminalni B, obogaćeni HER2, bazalni i s niskom razinom klaudina (Prat i sur., 2015.). TNBC je molekularni podtip raka koji ne eksprimira sve ER, PR i HER2 (Yin i sur., 2020.). Ove patološke značajke povezane su s TNBC-om, što potvrđuje njegovu brzu progresiju i agresivniju prirodu od bilo koje druge vrste raka dojke (Feng i sur., 2018.). Osim toga, Peru i sur. (2000.) koristili su tehnologiju mikročipova za reklasifikaciju raka dojke i identifikaciju pet intrinzičnih podtipova raka dojke (Cadenas, 2012.). Bazalni rak dojke je podtip raka dojke koji ima trostruko negativni fenotip i povezan je s brzom progresijom. Treba napomenuti da se svi bazalni karcinomi dojke često pogrešno dijagnosticiraju kao TNBC, ali samo 77% su TNBC; Nasuprot tome, 71–91% TNBC-a su bazalni, što ukazuje na to da se ove dvije vrste raka dojke preklapaju i predstavljaju različite klasifikacije (Wang D.-Y. i sur., 2019.). To stvara potrebu za karakterizacijom heterogenosti TNBC-a kako bi se razjasnila prognoza i identificirali potencijalni odgovori na trenutne i buduće tretmane. Osim toga, TNBC čini 15–20% svih slučajeva raka dojke i češći je kod žena mlađih od 50 godina. Mutacije BRCA1 ili BRCA2 zabilježene su u približno 20% slučajeva TNBC-a (Xie i sur., 2017.; Tzikas i sur., 2017., 2020.). Studije su također pokazale da TNBC ima različito imunološko mikrookruženje koje uključuje visoke razine faktora rasta vaskularnog endotela, makrofaga povezanih s tumorom (TAM), limfocita koji infiltriraju tumor (TIL) i drugih molekula uključenih u rast i migraciju tumora. Stoga je razumijevanje mikrookruženja TNBC-a ključno za njegovu prognozu i liječenje (Fan i He, 2022).
Za procjenu prognoze TNBC-a i osiguranje učinkovitog liječenja, važna je točna dijagnoza, uglavnom temeljena na imunohistokemiji (IHC) za otkrivanje ER, PR i HER2, te mamografiji za otkrivanje neoplazmi dojke. Međutim, mamografija ne može adekvatno prikazati intratumoralne značajke poput nekroze i fibroze (Deepak Singh i sur., 2021.). Budući da loša prognoza i dijagnoza sprječavaju liječnike da propišu prave lijekove (Chaudhary, 2020.), koriste se različite strategije za poboljšanje skrbi za pacijente s TNBC-om. Trenutno se dva lijeka, doksorubicin i ciklofosfamid, koriste kod pacijenata s TNBC-om i pokazali su dobre rezultate. Osim toga, koriste se i drugi lijekovi platine, poput karboplatina i cisplatina (Sikov i sur., 2015.). Osim toga, inhibitori PARP-a poput Olapariba, Velapariba i PF-01367338 korišteni su kao potencijalni kemoterapijski lijekovi za liječenje TNBC-a (Ishino i sur., 2018.). Budući da je objavljeno da su signalni putevi Wnt/b-katenina, NOTCH i Hedgehog uključeni u nastanak i napredovanje TNBC-a, ciljano djelovanje lijekova na te putove može biti važna strategija (Aysola i sur., 2013.). Iako kirurgija, radioterapija i kemoterapija ostaju glavni oslonac liječenja TNBC-a danas, postignut je značajan napredak u razvoju novih tretmana, uključujući ciljanu terapiju, imunoterapiju, razne alate za uređivanje gena povezane s CRISPR-om kao što su Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, primarno uređivanje i gensku terapiju usmjerenu na CRISPR/Cas9. Ovdje ćemo se usredotočiti na različite alate za uređivanje gena povezane s CRISPR-om koji se koriste u liječenju TNBC-a. Među njima, CRISPR/Cas9 je privukao široku pozornost.
Cas9n, također poznat kao Cas9 nikaza, genetski je modificirana varijanta proteina Cas9 izvedena iz sustava za uređivanje genoma CRISPR/Cas9 (Gupta i sur., 2019.). U svom izvornom obliku, protein Cas9 sadrži dvije nukleazne domene: RuvC i HNH, čija je glavna funkcija cijepanje oba lanca DNA. Međutim, u Cas9n-u, jedna od nukleaznih domena, HNH, je genetski mutirana i postaje neaktivna. Stoga, HNH domena Cas9n-a ostaje nefunkcionalna. Samo RuvC domena ostaje aktivna, što omogućuje Cas9n-u da reže ili stvara prekide na pojedinačnim lancima DNA (Trevino i Zhang, 2014.). U usporedbi s Cas9, Cas9n može učinkovito smanjiti učinke izvan cilja i precizno poboljšati mehanizme popravka stanica. Cas9n se može koristiti za rješavanje raznih problema, poput stvaranja prekida na određenim mjestima u dvolančanoj DNA. U tu svrhu, dvije molekule Cas9n su kombinirane i korištene zajedno (Yee, 2016.). Kinaza miješane loze 3 (MLK3) je mitogenom aktivirana proteinska kinaza koja služi kao ključni regulator tijekom metastaza TNBC-a (Cronan i sur., 2012.).
MLK3 može aktivirati više signalnih puteva koji dovode do metastaza TNBC-a. Na primjer, put c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) regulira pokretljivost stanica i razgradnju izvanstaničnog matriksa, a MLK3 aktivira JNK put, čime pojačava pokretljivost stanica i daje invazivna svojstva (Rattanasinchai i Gallo, 2016). MLK3 također regulira EMT. Da bi to učinio, aktivira nizvodne transkripcijske faktore kao što su Snail, Slug i Twist. Ovi faktori inhibiraju ekspresiju epitelnih markera i potiču ekspresiju mezenhimalnih markera, što dovodi do stjecanja metastatskog fenotipa (Casalino i sur., 2023). Opaženo je da MLK3 igra ulogu u preoblikovanju izvanceličnog matičnog tkiva (ECM) i aktivaciji proteaza kao što su matrične metaloproteinaze (MMP) koje razgrađuju ECM. To olakšava invaziju tumorskih stanica i širenje na udaljena mjesta (Katari i sur., 2019). Dakle, prethodne studije su pokazale da MLK3 igra ključnu ulogu u TNBC-u. Rattanasinchai i Gallo koristili su TNBC modele za proučavanje uloge MLK3 i otkrili da on potiče razvoj raka putem specifičnih signalnih puteva. Koristili su CRISPR/Cas9n za uređivanje MLK3 i uočili značajno smanjenje metastaza TNBC-a (Rattanasinchai i Gallo, 2016).
dCas9, često nazivan inaktivnim Cas9, modificirani je derivat proteina Cas9. Za razliku od aktivnog Cas9, dCas9 nema endonukleaznu aktivnost, što ga čini nesposobnim inducirati dvostruke prekide lanca DNA. Stoga se dCas9 može koristiti za precizno ciljanje specifičnih regija genoma bez ikakvih promjena ili modifikacija sekvence DNA (Wang i sur., 2016.). U dCas9, dva endonukleazna proteina, RuvC i HNH, inaktiviraju se potiskivanjem važnih aminokiselinskih ostataka. (Richter i sur., 2016.). Unatoč nedostatku aktivnosti cijepanja DNA, dCas9 igra niz važnih uloga u genetskim istraživanjima i biotehnologiji. Na primjer, omogućuje vizualizaciju specifičnih regija genoma, olakšava transkripcijsku regulaciju i potiče epigenetičke modifikacije (Brocken i sur., 2018.).
Transkripcijski faktor ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) igra specifičnu i ključnu ulogu u posredovanju epitelno-mezenhimalne tranzicije (EMT), staničnog procesa koji se događa tijekom embrionalnog razvoja, popravka tkiva i progresije raka. Uključuje transformaciju epitelnih stanica u mezenhimalne stanice, što rezultira promjenama u staničnoj morfologiji, pokretljivosti, invazivnosti itd. (Wu i sur., 2020.). ZEB1 inhibira više epitelnih markera, poput E-kadherina i okludina, koji su odgovorni za održavanje stanične adhezije i polarnosti epitelnih stanica u TNBC-u (Moreno-Bueno i sur., 2008.). Osim toga, ZEB1 aktivira određene markere poput N-kadherina, vimentina i fibronektina (Konradi i sur., 2014.), a također regulira gene uključene u preoblikovanje citoskeleta poput Rho GTPaza i matričnih metaloproteinaza (MMP) (Huang i sur., 2014.). 2022.), osim toga, utječe i na različite signalne puteve poput transformirajućeg faktora rasta β (TGF-β), Wnt signalizacije itd., čime potiče invaziju tumora i metastaze u TNBC-u (Chen i sur., 2016.). Brojne studije i znanstveni dokazi ukazuju na to da ZEB1 ima veliki potencijal kao vrijedno sredstvo za otkrivanje i terapijsku intervenciju TNBC-a. U nedavnoj studiji, Waryah i sur. koristili su TNBC model i postigli potpunu supresiju ZEB1 pomoću dCas9. Stoga su uočili vrlo visoku specifičnost i gotovo potpunu inhibiciju ZEB1 u in vivo uvjetima (Waryah i sur., 2023.).
CRISPR/Cas12 je alat za uređivanje gena pod nazivom CRISPR/Cpf1. Izveden je iz CRISPR/Cas sustava, gdje se termin Cas12 odnosi na CRISPR-povezani protein 12 (Bharathkumar i sur., 2022.), koji je potpuno sličan Cas9. Jedina je razlika što sadrži protein Cas12. U usporedbi s Cas9, Cas12 ima neke jedinstvene funkcije poput stvaranja ljepljivih krajeva tijekom procesa uređivanja gena, dok Cas9 stvara tupe krajeve (Wang i sur., 2021.). Ovo svojstvo Cas12 doprinosi njegovoj specifičnoj tehnologiji manipulacije DNK. Kao protein sposoban precizno prepoznati i rezati ciljnu DNK, ima izvanrednu svestranost, što ga čini učinkovitim alatom za razne primjene, uključujući uređivanje gena (Pickar-Oliver i Gersbach, 2019.).
Slično drugim CRISPR varijantama, CRISPR/Cas12 je također sposoban izbaciti ili aktivirati gene u TNBC-u, ciljajući gene koji igraju važnu ulogu u njegovoj patogenezi ili odgovoru na liječenje (Yang i Zhang, 2023.). Kako bi se postigao ovaj proces, razvijena je vodička RNA (gRNA) koja usmjerava Cas12 na ciljni gen. Nakon što se Cas12 veže za svoj cilj, uvodi dvostruke prekide u DNA i aktivira mehanizme popravka DNA. Tijekom procesa popravka mogu se ugraditi netočni nukleotidi, što dovodi do mutacija gena i gubitka funkcije (Zhang i sur., 2021a). Osim toga, poboljšana verzija enzima Cas12 (nazvanog dCas12) također je korištena za aktiviranje gena. Kombiniranjem s aktivatorom transkripcije moguće je inducirati određene gene, čime ih aktivirati. Ova tehnologija ima veliki potencijal u poticanju aktivacije gena supresora tumora (Sultan i sur., 2022.).
Prime editiranje je novo razvijena i iznimno superiorna tehnologija uređivanja genoma. Sposobna je vrlo precizno modificirati DNK organizma (Chen i Liu, 2023.). Prime editiranje postiže se integracijom dvije glavne komponente: modificiranog enzima CRISPR/Cas9 i reverzne transkriptaze. Uloga enzima CRISPR/Cas9 je selektivno ciljati precizna mjesta u genomu, dok reverzna transkriptaza pomaže u temeljitoj modifikaciji DNK na ciljnom mjestu (Hassan i sur., 2021.). U mehanizmu uređivanja primera, prvi korak uključuje stvaranje RNA vodiča za uređivanje primera (pegRNA) (Standage-Beier i sur., 2021.). Sadrži ciljni slijed i RNA predložak koji odgovara željenom mjestu uređivanja u ciljnoj DNK. PegRNA se zatim uvodi u ciljne stanice zajedno s nukleazom za uređivanje primera (PE2). PE2 je fuzijski protein koji se sastoji od enzima Cas9, reverzne transkriptaze i adaptera za uređivanje primera (Martín-Alonso i sur., 2021.). Unutar stanice, pegRNA i PE2 kompleksi traže specifičnu DNK koju žele modificirati. Enzim Cas9 reže DNK i stvara predložak koji se sastoji od pojedinačnih lanaca (Choi i sur., 2022.). Reverzna transkriptaza koristi ovaj predložak za pripremu DNK za uređivanje. Uz kopiranje DNK, uključene su i upute za uređivanje predloška RNA. Konačno, novostvoreni lanac DNK koristi se kao predložak za popravak prekida u DNK, što rezultira promijenjenim nizom DNK koji sadrži željenu modifikaciju (Ochoa-Sanchez i sur., 2021.). Mehanizmi uređivanja primera mogu dovesti do široko rasprostranjenih mutacija u genima. Mogu ciljati točkaste mutacije, insercije, delecije, pa čak i zamjene gena (Anzalone i sur., 2019.; Chen i Liu, 2023.). Prime uređivanje nudi nekoliko prednosti u odnosu na prethodne tehnologije uređivanja genoma. To uključuje povećanu točnost, smanjene učinke izvan cilja i mogućnost uređivanja DNK bez oslanjanja na dvostruke prekide DNK (Anzalone i sur., 2020.).
CRISPR/Cas9 tehnologija izvorno je razvijena za zaštitu bakterija od prijenosa plazmida i fagnih infekcija, a kasnije je prenamijenjena kao učinkovit alat za ciljanje DNA temeljen na RNA za uređivanje genoma (Jiang i Doudna, 2017.). Osim toga, zabilježeno je da je CRISPR/Cas9 sustav prisutan u 50% odnosno 87% bakterijskih i arhealnih genoma (Ishino i sur., 2018.). CRISPR/Cas9 je potencijalni alat za brisanje, umetanje i ispravljanje bilo koje abnormalne genetske sekvence korištenjem in vivo i in vitro načina rada (Sabit i sur., 2021.). Štoviše, pokazalo se da je CRISPR/Cas9 dio adaptivnog imunološkog sustava zbog svoje specifičnosti za ciljne gene od interesa (Chen i Zhang, 2018.).
CRISPR/Cas9 se sastoji od Cas9 i jedne vodičke RNA (sgRNA). Cas9 je endonukleaza sastavljena od više proteinskih komponenti. Osim toga, Cas9 ima jedinstvena strukturna i konformacijska svojstva (Pacesa i sur., 2022.) jer se sastoji od dva režnja: režnja za prepoznavanje (REC) i nukleaze (NUC). REC režanj je dalje podijeljen u tri regije: REC1, REC2 i mostne helikse (Cromwell i sur., 2018.). NUC se sastoji od tri režnja, i to RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH i interakcijske domene susjednog motiva protospacera (PAM) (slika 1) (Song i sur., 2016.). sgRNA se sastoji od dvije komponente, uključujući CRISPR RNA (crRNA) i transkodirajuću malu RNA (tracer RNA) (slika 1). SgRNA povezuje protein Cas9 s koneksinima kako bi formirala aktivni kompleks, također poznat kao efektorski kompleks (Richter i sur., 2012.). crRNA je bazni par od 18-20 nukleotida koji igra ključnu ulogu u prepoznavanju ciljnih sekvenci DNA. Osim toga, crRNA se uparuje s ciljnom DNA, a tracrRNA djeluje kao skela za nukleazu Cas9 da se veže za ciljnu DNA (Manghwar i sur., 2019.). S druge strane, PAM sekvenca ima 3 nukleotida, što potvrđuje, specificira i posreduje vezanje efektorskog kompleksa za DNA. Podjedinice RuvC i HNH proteinskog kompleksa Cas9 imaju katalitičku aktivnost (Richter i sur., 2012.; Asmamaw i Zawdie, 2021.). HNH nukleazna domena podjedinice Cas9 cijepa lanac DNA povezan s crRNA. Nukleazna domena RuvC cijepa druge lance DNA i generira dvostruke prekide lanca (DSB), nakon čega se aktiviraju dva različita mehanizma popravka prekida DNA (Jiang i Doudna, 2017.) (Slika 1).
Slika 1. Pregled CRISPR/Cas9 (A). Komponente CRISPR/Cas9 sustava: (i). Cas9 endonukleaza odgovorna je za rezanje ciljne DNA sekvence, (ii) jedna vodička (sg) RNA koja nastaje fuzijom crRNA i tra-crRNA himera. (dvije). Cas9 uključuje nekoliko komponenti kao što su Rec I, Rec II, NUC režanj (HNH i Ruv C su podkomponente) i PAM interakcijska domena (C) s odgovarajućim funkcijama. Proteinski kompleks CRISPR/Cas9 cijepa DNA sekvence u nekomplementarne i komplementarne oblike (D). CRISPR/Cas9 uređuje genom u tri faze: prepoznavanje, rezanje i popravak. Dizajnirana sg-RNA vodi Cas9 i prepoznaje željenu sekvencu putem komplementarne komponente crRNA. Cas9 prepoznaje PAM sekvencu na 5′-NGG-3′ i topi DNA, formirajući DNA-RNA hibrid i aktivirajući cijepanje. HNH domena Cas9 cijepa komplementarni lanac, a RuvC domena cijepa nekomplementarni lanac. CRISPR/Cas9 popravlja dsDNA prekidajući je na dva načina: spajanjem nehomolognih krajeva (NHEJ) i popravkom usmjerenim na homologiju (HDR). NHEJ popravlja dvolančanu DNK u odsutnosti strane homologne DNK putem enzimskog procesa, mehanizma sklonog pogreškama koji može umetnuti ili ukloniti nasumične sekvence DNK. HDR je vrlo specifičan i zahtijeva homologne DNK predloške.
CRISPR/Cas9-posredovani putevi popravka uključuju mehanizme nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) i homologijom usmjerenog popravka (HDR). NHEJ je put sklon pogreškama jer uključuje umetanje ili brisanje i ne zahtijeva nikakav obrazac tijekom mehanizma popravka. Koristi nasumične nukleotide za generiranje standardnih proteina (Abbasi i sur., 2021.). Ovaj sustav popravka sastoji se od četiri kompleksa kao što su KU kompleks, unakrsno komplementirajući proteinski kompleks tipa 4 (XRCC-4), enzim za obradu krajeva DNA i protein kinaza DNA-PKcs (Abbasi i sur., 2021.). Protein KU kompleksa ima dvije podjedinice, Ku 70 i Ku 80, i igra važnu ulogu u mehanizmu NHEJ-a, budući da se mehanizam popravka pokreće vezanjem dviju podjedinica (Ku 70 i Ku 80) na tupe ili gotovo tupe krajeve ciljne DNA (Abbasi i sur., 2021.), služeći kao skela za regrutiranje drugih čimbenika povezanih s NHEJ-om na mjesto ozljede (Yang i sur., 2020.). XRCC-4 i DNA ligaza sastoje se od 334, odnosno 911 aminokiselina, a kompleks XRCC4-DNA ligaze IV stimulira ligaciju krajeva DNA (Chatterjee i sur., 2015.). Enzim za obradu krajeva DNA, također poznat kao polinukleotid kinaza 3'-fosfat, je enzim za obradu krajeva DNA. Može ukloniti 3'P skupinu u DNA i fosforilirati 5'OH skupinu tijekom popravka DSB-a. Također uključuje popravak jednolančanih prekida (SSB) korištenjem SSB puta popravka (Chatterjee i sur., 2015.). Proteinska kinaza DNA-PKcs je DNA-ovisna proteinska kinaza koja se sastoji od katalitičke podjedinice PIKK-ova (kinaza povezanih s fosfatidilinozitolom 3-kinazom) i obitelji ataksija telangiektazija mutiranih (ATM), kao i ATR-ova povezanih s ATM-om i Rad3, prekida lanca (DSB) i jednolančanih prekida (Yue i sur., 2020.; Peng i sur., 2016.).
HDR je točniji i prikladniji mehanizam popravka jer se informacije kopiraju korištenjem netaknutog oblika homolognog DNA dupleksa, iako zahtijeva prisutnost sestrinskih kromatida. To se događa tijekom S/G2 faze staničnog ciklusa sisavaca. HDR se javlja uglavnom kod vrsta kvasaca, ali NHEJ je ključan kod sisavaca (Burma i sur., 2006.; Abbasi i sur., 2021.). Potpuni mehanizam popravka prikazan je na slici 1.
Budući da je TNBC uzrokovan genetskim i epigenetičkim abnormalnostima, korekcija malignih genomskih/epigenomskih abnormalnosti pomoću CRISPR/Cas9 može biti razuman terapijski pristup (Chen i sur., 2019.). Osim toga, neki transkripcijski faktori uključeni u staničnu transkripcijsku regulaciju mogu pokazivati jedinstvene karakteristike stanica raka, što sugerira da transkripcijska regulacija može biti izvrstan pristup liječenju raka (Drost i sur., 2017.). Iskorištavanje ovih molekularnih značajki tumora, poput genetskih, epigenetskih i transkripcijskih defekata, za razvoj lijekova može poboljšati kliničke ishode i smanjiti troškove probira. CRISPR je potencijalni alat za uređivanje gena koji ne samo da može otkriti i identificirati genomske ciljeve koji uzrokuju rak, već se može koristiti i za uređivanje, suzbijanje i epigenetičku modifikaciju onkogena u ljudskim stanicama (Tablica 1) (Ahmed i sur., 2021.). Provedeno je nekoliko CRISPR probira kako bi se pronašli geni povezani s tumorskim supresorima, onkogenima i otpornošću na lijekove. Korištenje CRISPR/Cas9 za uređivanje različitih onkogena TNBC-a prikazano je na slici 2.
Slika 2. Uređivanje gena različitih onkogena TNBC-a pomoću CRISPR/Cas9 što rezultira smanjenim rastom tumora i metastazama. Ovi onkogeni uključuju CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 i CXCR7, Crypto1, ROR1 i ST8SIA, koji su uključeni u pojavu i metastaze TNBC-a.
Migracija, invazija stanica raka i epitelno-mezenhimalna tranzicija (EMT) povezani su s ITGA9. Prethodne studije pokazale su da je ITGA9 ključni igrač u Notch putu i igra zanimljivu ulogu u metastazama rabdomiosarkoma (Molist i sur., 2020.). Osim toga, utvrđeno je da je ITGA9 usko povezan s prognozom pacijenata kod nekoliko vrsta tumora, uključujući rak dojke (Wang Z. i sur., 2019.). Osim toga, bioinformatička analiza ITGA9 pokazala je da je njegova ekspresija u TNBC-u značajno veća nego u drugim podtipovima raka dojke. Povišene razine ITGA9 povezane su s metastazama tumora i relapsom kod pacijenata s TNBC-om. Nokautiranje ITGA9 pomoću CRISPR/Cas9 rezultiralo je svojstvima sličnim matičnim stanicama raka (CSC), angiogenezom tumora, rastom tumora i smanjenjem metastaza promoviranjem razgradnje β-katenina u TNBC-u (Wang Z. i sur., 2019.).
Kripto-1 je član TGF-β obitelji i ključan je za ranu embriogenezu, održavanje matičnih stanica i metastaze raka (Ishii i sur., 2021.). Također poznat kao Tdgf-1, onkogeni je GPI-usidreni signalni protein uključen u regulaciju stvaranja primitivne pruge, mezoderma i endoderma, kao i u uspostavljanje lijeve/desne asimetrije u razvoju tjelesnih organa tijekom embriogeneze (Zhang i sur., 2021b). Osim toga, pokazalo se da je Cripto-1 uključen u epitelno-mezenhimalnu tranziciju (EMT) kao marker matičnih stanica (Zhang i sur., 2021b). EMT je ključan ne samo za različite procese poput embrionalnog razvoja, fibroze i zacjeljivanja rana, već i za invaziju i metastaze raka. Osim toga, pokazalo se da Cripto-1 interagira s četiri Notch receptora i pojačava njihovo posttranslacijsko sazrijevanje (Brandstadter i Maillard, 2019.). Poznato je da je Notch signalni put uključen u održavanje stanica raka dojke kod ljudi. Studije su pokazale da CRISPR/Cas9-posredovano nokautiranje Crypto-1 potiskuje rast i metastaze raka. Stoga bi Crypto-1 mogao postati važna terapijska meta za TNBC (Castro i sur., 2015.).
Protein XCL12 i njegov kemokin receptor CXC (CXCR4 i CXCR7) igraju različite uloge u proliferaciji, rastu, migraciji i invaziji stanica raka (Wu i sur., 2015.). Ovi kemoreceptori povezani su s razvojem TNBC-a putem više signalnih putova i u in vivo i in vitro modelima (Wu i sur., 2015.). Osim toga, aktivacija CXCR4 i CXCR7 povezana je s većom osjetljivošću na metastaze i lošom prognozom kod TNBC-a (Karn i sur., 2022.). Stoga, nokautiranje CXCR4 i CXCR7 može postati učinkoviti geni za liječenje raka dojke, uključujući TNBC. Studija Yanga i sur. Yang i sur. (2019.) koristili su CRISPR/Cas9 za ko-nokautiranje gena CXCR4 i CXCR7 i otkrili da su proliferacija, rast, migracija i invazija TNBC-a značajno inhibirani (Yang i sur., 2019.).
Povećane razine miR-3662, onkogena TNBC-a, uočene su u tkivima raka dojke (Yi i sur., 2022.). Pokazalo se da suzbijanje miR-3662 inhibira rast i metastaze tumora raka dojke i in vivo i in vitro (Agarwal i Gupta, 2021.). HBP-1 je snažan inhibitor Wnt/-katenin signalizacije i vjerojatno je odgovoran za rast TNBC stanica posredovan miR-3662. Nedavno su Yi i sur. otkrili da os miR-3662-HBP1 regulira Wnt/-katenin signalni put u TNBC stanicama (Yi i sur., 2022.). Zbog svoje tumor-specifične ekspresije, miR-3662 može biti potencijalna terapijska meta za TNBC. Stoga bi CRISPR/Cas9-posredovano suzbijanje miR-3662 moglo biti izvrstan pristup za razvoj novih lijekova za liječenje TNBC-a.
UBR5 je nukleofosfoprotein od 300 kDa koji je identificiran kao ključni regulator tumorogeneze, metastaza i imunološkog odgovora u raznim vrstama raka (Shearer i sur., 2015.; Fu i sur., 2023.). Izviješteno je da je UBR5 visoko pojačano izražen u uzorcima TNBC-a i stimulira funkciju ERα induciranjem proliferacije putem svoje aktivnosti ubikvitin ligaze (Bolt i sur., 2015.). Studije sekvenciranja cijelog egzoma primarnih uzoraka TNBC-a također su pokazale povećanu ekspresiju UBR5, što sugerira njegovu ulogu u razvoju TNBC-a. Osim toga, delecija UBR5 uzrokovana CRISPR/Cas9 pokazala je značajnu inhibiciju metastaza i rasta TNBC-a u eksperimentalnim modelima miševa. Štoviše, uključivanje UBR5 u model miša divljeg tipa vratilo je njegovu punu funkcionalnost, dok taj učinak nije uočen u inaktiviranim mutantnim sojevima (Liao i sur., 2017.). Nedostatak UBR5 povezan je s povećanom apoptozom, nekrozom i inhibicijom rasta tumora u TNBC-u zbog slabe angiogeneze. Zbog gubitka UBR5, širenje tumora na udaljene organe je smanjeno, a UBR5 inducira abnormalni EMT uglavnom smanjenjem ekspresije E-kadherina (Zhang i Weinberg, 2018). Nedavno se pokazalo da je UBR5 vrlo važan faktor u transkripciji PDL1 induciranoj IFN-γ u TNBC-u zbog nedostatka aktivnosti ubikvitinacije E3. Analiza RNA transkriptoma otkrila je da UBR5 može imati sistemske učinke na gene povezane s IFN-γ putem i promovirati transaktivaciju PDL1 povećanjem razine aktivacije protein kinaze RNA (PKR) i njezinih signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije 1 (STAT1) i regulatornog faktora interferona 1 (IRF1). Međutim, kombinirana ablacija ekspresije UBR5 i PD-L1 posredovana CRISPR/Cas9 ima sinergistički terapijski učinak od bilo koje blokade zasebno, s dubokim učincima na mikrookruženje tumora (Wu i sur., 2022). Stoga, CRISPR/Cas9 može biti važan alat za inhibiciju funkcije UBR5, čime se potiskuju metastaze TNBC-a i rast tumora.
ROR1 je transmembranski protein tipa I koji se eksprimira tijekom raka i embrionalnog razvoja te je identificiran kao onkofetalni protein (Nicholas Borcherding, 2014.). Invazivno ponašanje različitih ljudskih karcinoma povezano je s pojačanom regulacijom ROR1. Obećavajući rezultati dobiveni su iz in vivo i in vitro studija koje uključuju terapijske spojeve usmjerene na ROR1 (Chien i sur., 2016.). Povišene razine ROR1 mRNA u biopsijama tkiva dojke također su povezane s agresivnim bazalnom tumorima dojke (BL) i njihovom migracijom u druge dijelove tijela. Štoviše, prekomjerna ekspresija ROR1 identificirana je kao prognostički marker za razvoj TNBC-a (Chien i sur., 2016.). Međutim, utišavanje ROR1 pomoću CRISPR/Cas9 za suzbijanje rasta i metastaza TNBC-a bila bi učinkovita strategija.
Proces sialilacije uključuje dodavanje sijalinske kiseline glikokonjugatima, što kataliziraju sialiltransferaze (ST). ST8SIA1 pripada ST obitelji i igra važnu ulogu u patogenezi raznih bolesti poput limfocitne leukemije i kolorektalnog karcinoma (Chang i sur., 2018.). Analiza RNA sekvence pokazuje da je ST8SIA1 visoko eksprimiran u tkivu dojke pacijenata s TNBC-om i pozitivno je koreliran s mutacijama u genu tumor supresora p53, što može doprinijeti patogenezi TNBC-a (Battula i sur., 2017.). Osim toga, ST8SIA1 je uključen u metastaze i ponovnu pojavu TNBC-a, što sugerira da igra važnu ulogu u pojavi i razvoju TNBC-a. U in vitro modelu TNBC-a, pokazano je da suzbijanje ST8SIA1 pomoću CRIPSR/Cas9 blokira rast i metastaze (Battula i sur., 2017.). To sugerira da bi CRISPR/Cas9 mogao biti važan alat za inhibiciju funkcije onkogena ST8SIA1 u liječenju TNBC-a.
NAT1 je metabolički enzim koji katalizira stvaranje ksenobiotičkih spojeva faze II i eksprimira se u gotovo svim ljudskim tkivima. NAT1 može koristiti kofaktor folat za ciljanje acetil-CoA (acetil-CoA) čak i u odsutnosti aromatskog aminskog supstrata (Stepp i sur., 2015.; Laurieri i sur., 2014.). Studije su pokazale da NAT1 regulira funkciju matrične metaloproteinaze 9 (MMP9) u modelima stanica raka dojke i štiti od reaktivnih vrsta kisika (ROS) tijekom gladovanja glukozom (Wang i sur., 2018.). Pokazalo se da delecija NAT1 inhibira kompleks piruvat dehidrogenaze, što dovodi do mitohondrijske disfunkcije (Wang L. i sur., 2019.). Osim toga, razna druga izvješća pokazala su da inhibicija NAT1 korištenjem malih molekula i utišavanja siRNA može smanjiti invazivnost i proliferaciju stanica raka dojke (Stepp i sur., 2018.). Nedavno je CRISPR/Cas9 korišten za suzbijanje NAT1 u staničnoj liniji raka dojke MDA-MB-231, utječući na stanični metabolizam ovisno o razini ekspresije. Ova studija je također pokazala da je NAT-1 ključan za napredovanje i metastaze TNBC-a (Carlisle i sur., 2020.).
Koordiniranu transkripciju onkogena reguliraju super pojačivači, transkripcijski faktori i kofaktori (Hnisz i sur., 2015.). Osim toga, za transkripcijsku regulaciju potrebna je skupina ciklin-ovisnih kinaza (CDK), kao što su CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 i CDK13. Među njima, CDK7 je uključen u fosforilaciju RNA polimeraze II, što je vrlo važno za inicijaciju i širenje transkripcije onkogena u patogenezi TNBC-a. U jednoj značajnoj studiji, delecija CDK7 pomoću CRISPR/Cas9 inhibirala je TNBC, što ukazuje na to da je patogeneza TNBC-a ovisna o CDK7 (Wang Y. i sur., 2015.).
Studije su pokazale da mutacije u MYC i RBP (protein koji veže RNA) mogu dovesti do apoptoze, dok mutacije pojedinačnih gena u MYC ili RBP ne utječu na rast stanica raka (Einstein i sur., 2021.). Više od 1000 RBP-ova u ljudskom genomu pregledano je pomoću biblioteke temeljene na CRISPR/Cas9. Među njima, utvrđeno je da je 57 RBP-ova ključno za rast stanica raka s visoko povišenim razinama MYC (Wheeler i sur., 2020.). Osim toga, YTHDF2 je važan za održavanje rasta stanica TNBC-a i smanjuje količinu metiliranih transkripata tijekom transkripcije i translacije na visokoj razini u stanicama raka s višom ekspresijom MYC-a. Osim toga, YTHDF2 nije esencijalan za stanice raka, koje su manje ovisne o povišenim razinama MYC-a za produljenje preživljavanja pacijenata s TNBC-om (Einstein i sur., 2021.), što sugerira da bi mogao biti potencijalna terapijska meta za lijekove koji mogu prevladati TNBC.
Proteini cinkovih prstiju (ZNF) čine otprilike 1% ukupnog ljudskog genoma. Studije su pokazale da ZNF može regulirati proliferaciju stanica u raznim vrstama raka, poput raka jetre, raka dojke i kolorektalnog raka (Zhang W. i sur., 2021.; Li i sur., 2017.). Biblioteke generirane CRISPR knockoutom korištene su za probir različitih gena supresora tumora (TSG) u stanicama raka dojke (Shalem i sur., 2014.). Od tada je transkriptomska studija stanica raka dojke s izbrisanim CRISPR/Cas9 ZNF319 pokazala da je ZNF319 gen supresor tumora koji smanjuje proliferaciju raka dojke i stoga je uključen u različite potencijalne mehanizme signalizacije i druge biološke funkcije (Wang L. i sur., 2022.).
Feroptoza je vrsta programirane stanične smrti koja ovisi o prisutnosti željeza. Poznato je da na razvoj feroptoze utječe prisutnost lipidnih peroksida. Osim toga, zabilježeno je da PKCβII pokazuje ranu lipidnu peroksidaciju, a povećana lipidna peroksidacija povezana je s feroptozom. Probir biblioteke inhibitora kinaze posredovanih CRISPR/Cas9 otkrio je da je PKCβII uključen u proces lipidne peroksidacije, što je ključno za feroptozu u stanicama MDA-MB-231 (Zhang i sur., 2022.). Stoga, ovo sugerira da bi nokautiranje PKCβII pomoću CRISPR/Cas9 moglo biti potencijalna meta gena supresora tumora za liječenje bolesti povezanih s feroptozom (Zhang i sur., 2022.).
Vjeruje se da je otpornost na lijekove odgovorna za otprilike 90% smrtnih slučajeva kod pacijenata oboljelih od raka i jedan je od glavnih izazova u liječenju raka (Bukowski i sur., 2020.). Rezultati pokazuju da je dovoljan broj gena povezanih s izlučivanjem lijekova, popravkom DNK, apoptozom i različitim staničnim signalnim putovima povezan s otpornošću na lijekove (Haider i sur., 2020.). Među njima, nekoliko gena je ciljano CRISPR/Cas9 alatima i pokazalo je obećavajuće rezultate u smanjenju otpornosti na lijekove i povećanju učinkovitosti liječenja raka (Vaghari-Tabari i sur., 2022.). Osim toga, visokopropusne CRISPR/Cas9 biblioteke za probir knockouta gena implicirane su u modificiranju funkcije potencijalnih ciljeva gena otpornosti na lijekove (Shalem i sur., 2015.). Za identifikaciju gena otpornosti na paklitaksel, korišteno je sekvenciranje RNA u kombinaciji sa probirom biblioteke sgRNA na razini cijelog genoma kako bi se identificiralo osam kandidatskih gena, uključujući histon deacetilazu 9 (HDAC9), koji su povezani s otpornošću na lijekove kod pacijenata s rekurentnim TNBC-om (B i sur., 2020.). U drugoj studiji, povećana ekspresija diserina/treonina i tirozin protein kinaze (DSTYK) uočena je tijekom preživljavanja pacijenata s TNBC-om liječenih lijekovima protiv raka. Štoviše, CRISPR/Cas9-posredovano smanjenje ekspresije DSTYK-a značajno je poboljšalo apoptozu stanica raka otpornih na lijekove in vitro (stanice SUM102PT i stanice MDA-MB-468) i in vivo TNBC model (Ogbu i sur., 2021.).
Iako TNBC ima abnormalnu aktivaciju MAPK puta, klinički učinak terapija usmjerenih na MEK je slab. Probir genomske knjižnice CRISPR/Cas9 otkrio je da inhibicija PSMG2 (šaperon 2 za sklapanje proteoma) senzibilizira TNBC BT549 i MB468 stanice na inhibitor MEK AZD6244. Nokdaun PSMG2 pomoću CRISPR/Cas9 promijenio je normalnu funkciju proteasoma, što je dovelo do autofagijom posredovane rastavljenosti PDPK1, čime se dodatno poboljšavaju tumorske stanice u mišjim modelima TNBC-a induciranim AZD6244 (inhibitor MEK) i MG132 (inhibitor proteasoma). Stoga se inhibitori proteasoma i MAP kinaze (MEK) mogu sinergistički primjenjivati kako bi se smanjila proliferacija tumorskih stanica (Wang X. i sur., 2022.).
CRISPR/Cas9 je također korišten za probir gubitka funkcije gena što dovodi do rezistencije na TNBC (Shu i sur., 2020.). Ge i sur. objasnili su mehanizam rezistencije na lijekove stanica raka tretiranih s JQ1, inhibitorom BET bromodomene (BBDI), u TNBC-u. Koristeći CRISPR/Cas9, otkrili su da brisanje gena rb1 uzrokuje da TNBC postane otporan na lijek protiv raka JQ1. Stoga je funkcija rb1 važna u odgovoru na lijekove JQ1 u TNBC-u. Također su izvijestili da je paklitaksel inhibitor CDK4/6 kinaze/mikrotubula, a njegova kombinacija s BBDI-jima poput JQ1 može pružiti obećavajuće terapijske odgovore na TNBC otporan na lijekove (Ge i sur., 2020.).
Izviješteno je da je transkripcijski krajolik duge nekodirajuće RNA (lncRNA) odgovoran za otpornost na neoadjuvantnu terapiju u TNBC-u. Ova studija pokazuje da je pet različitih MALAT1 lncRNA transkripata visoko eksprimirano u TNBC-u. Osim toga, CRISPR/Cas9-posredovana delecija MALAT1 povećala je osjetljivost TNBC BT-549 stanica na paklitaksel i doksorubicin, što sugerira potencijalnu ulogu MALAT1 otpornosti u TNBC-u (Shaath i sur., 2021.).
Mutacije u BRCA1 (BRCA1m) su heterogene i stoga ih je teško otkriti. Ciljanje PARP1 (poli(ADP-riboza) polimeraza), sintetskog letalnog partnera BRCA1, može povećati kemosenzitivnost na lijekove TNBC-a. Korištenjem CRISPR/Cas9, delecija PARP1 povećala je osjetljivost lijekova protiv raka poput doksorubicina, gemcitabina i docetaksela na mBRCA1 mutantne TNBC stanice, što sugerira da je PARP1 također uključen u rezistenciju na lijekove u TNBC-u (Vaghari-Tabari i sur., 2022.). Poznato je da mutacije u genima tumor supresora BRCA1 ili BRCA2 povećavaju vjerojatnost razvoja raka dojke kod ljudi. Liječenje ovih pacijenata zahtijeva upotrebu inhibitora PARP-a. Osim toga, dokazano je da nokautiranje faktora spašavanja nukleotida DNPH1 pomoću CRISPR/Cas9 može ukloniti toksični nukleotid 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat, čime se pojačava odgovor stanica s nedostatkom BRCA na osjetljivost na inhibitore PARP (Fugger i sur., 2021.). Stoga bi inhibitori CRISPR/Cas9 i PARP1 mogli postati važna strategija liječenja TNBC-a.
Gen za penetrantni glikoprotein (P-gp) je gen za višestruku rezistenciju na lijekove koji je općenito pojačano izražen u približno 41% svih TNBC-a (Sun i sur., 2020.). Izlučivanje lijeka inducirano P-gp-om identificirano je kao ključni regulator rezistencije na lijekove kod raka dojke. Inhibitori P-gp-a pokazali su povećanu osjetljivost na lijekove protiv raka dojke (Famta i sur., 2021.). Stoga, ablacija ili supresija P-gp-a i inhibitora P-gp-a posredovana CRISPR/Cas9-om mogu biti vrlo važne metode za prevladavanje rezistencije na lijekove kod TNBC-a.
Poznato je da ATP-vezujući kasetni transporter G2 (ABCG2) uzrokuje rezistenciju na lijekove kod TNBC-a (Palasuberniam i sur., 2015.), iako trenutno nema izvješća o odnosu između CRISPR/Cas9 i utišavanja ABCG2 te inaktivacije gena tumorskog supresora. PTEN može pojačati aktivaciju ABCG2 (Palasuberniam i sur., 2015.), (Deepak Singh i sur., 2021.). Stoga, korištenje CRISP/Ca9 za uklanjanje ABCG2 i kombiniranje s inhibitorom ABCG2 može biti prikladan tretman za prevladavanje rezistencije na lijekove kod TNBC-a. Tablica 2 spominje CRISPR/Cas9 koji cilja sve gene rezistencije.
Tablica 2. CRISPR/Cas9 cilja različite gene otpornosti na TNBC kako bi senzibilizirao stanice na lijekove protiv raka.
CRISPR/Cas9 biblioteke su potencijalni alati za probir genskih mutacija povezanih s patogenezom raka (Chan i sur., 2022.). Ova metoda probira uključuje četiri koraka kao što su (a) konstrukcija biblioteke, (b) lentivirusna transdukcija, (c) fenotipski probir i (d) analiza ciljnih gena. Iako TNBC ima abnormalnu aktivaciju MAPK puta, klinička prognoza MEK ciljane terapije za pacijente s TNBC-om koji nose mutacije u tumor supresorskim genima kao što su PTEN, RB1 i TP53 je vrlo loša.
Osim toga, probir gena s izostavljanjem pomoću CRISPR/Cas9 testirao je najpotentniju i najselektivniju molekulu, dehidrokatrol, koja je obilna u ekstraktima gvatemalskog cvijeća i lišća, kako bi se razumio učinak dehidrokatrola na MDA-MB-231. Mehanizmi selektivne citotoksičnosti stanica. Karakteristike mezenhimalne matičnosti TNBC podtipova. Ovaj probir temeljen na CRISPR/Cas9 također je otkrio da je HSD17B11, gen koji kodira 17β-hidroksisteroid dehidrogenazu tip 11, visoko eksprimiran u stanicama MDA-MB-231 i rezultira dehidrofalkarinolom specifičnim za stanice MDA-MB-231 (Grant i sur., 2020.). Dakle, ovo sugerira da genomski probir CRISPR/Cas9 ima veliki potencijal u identificiranju mehanizama koji leže u osnovi antikancerogenih svojstava potencijalnih prirodnih spojeva.
Osim toga, ranjivost TNBC-a na rak proučavana je korištenjem nepristranog in vivo CRISPR/Cas9 probira na razini cijelog genoma, koji je pokazao vezu između onkogenih i tumor supresorskih puteva. Izviješteno je da ključne komponente mTOR i Hippo puteva igraju važnu ulogu u regulaciji tumora u TNBC-u. Osim toga, studije su pokazale da farmakološka inhibicija onkoproteina mTORC1/2 i YAP učinkovito inhibira patogenost TNBC-a korištenjem in vitro modela sinergije lijek-matrica i in vivo ksenograftova izvedenih od pacijenata. Štoviše, inhibicija mTORC1/2 posredovana Torin-1 pojačava makropinocitozu, dok inhibicija YAP-a inducirana verteporfinom dovodi do smrti stanica TNBC-a. Uzeti zajedno, ovi rezultati ističu snagu i robusnost in vivo CRISPR probira na razini cijelog genoma za identifikaciju novih i učinkovitih tretmana za TNBC (Dai i sur., 2021.).
Disregulacija imunološkog sustava važan je čimbenik u tumorogenezi. Stanice raka izbjegavaju imunološko čišćenje zaobilazeći obrambene mehanizme, uključujući ometanje aktivnosti imunoloških stanica u mikrookruženju tumora i ugrožavanje imunološkog sustava. Stoga, razvoj poboljšanog imunološkog sustava može biti ključni pristup borbi protiv tumora. Korištenje modifikacije gena temeljene na CRISPR/Cas9 rješava nekoliko problema povezanih s imunološkom disfunkcijom iz različitih perspektiva. CRISPR/Cas9 se koristi za poboljšanje antitumorskog imuniteta protiv raka dojke putem sljedećih puteva (Slika 3).
Slika 3. Imunoterapija CRISPR/Cas9 cilja TNBC stanice. Gubitak CDK5 i smanjenje ekspresije PDL1 i CD155 jačaju imunološki sustav. Slično tome, gubitak A2AR-a i smanjenje ekspresije TAA proteina poput HER2, mucina 1 i TEM8 povećali su učinkovitost CAR-T stanica u ubijanju stanica raka. Probir T stanica vođen CRISPR/Cas9 pokazao je da poremećaj p38 kinaze pojačava antitumorsku aktivnost T stanica. T stanice modificirane CRISPR/Cas9 povećavaju ekspresiju TCR-a (receptora T stanica), što rezultira antitumorskom aktivnošću T stanica.
Cilj imunoterapije je stimulirati imunološki sustav da napadne stanice raka. Prekomjerna ekspresija proteina imunoloških kontrolnih točaka obično sprječava autoimune reakcije, ali može pomoći raku da ih izbjegne (Topalian i sur., 2015.). Ovi proteini sprječavaju imunološke reakcije vezanjem na receptore na površini imunoloških stanica. Višestruki proteini kontrolnih točaka (poput CD155 i PD-L1) ciljaju PD-1 receptor na imunološkim stanicama i eksprimiraju se u raku dojke, posebno TNBC-u (Li Y.-C. i sur., 2020.). Smanjenje ekspresije PD-L1 ili njegovog receptora pomoću CRISPR/Cas9 može stimulirati imunološki sustav da napadne tumore TNBC-a (Yahata i sur., 2019.). Osim toga, pokazalo se da smanjenje ekspresije PD-L1 putem CRISPR/Cas9-posredovane delecije CDK5 inhibira rast tumora in vitro i in vivo (Deng i sur., 2020.). Inhibicija rasta u in vitro i in vivo modelima raka dojke sugerira da bi smanjenje CD155 posredovano shRNA moglo imati terapijski učinak na rak dojke (Gao i sur., 2018.).
CAR T stanice eksprimiraju CAR-ove koji prepoznaju antigene povezane s tumorom (TAA) i mogu koristiti eliminaciju proteina kontrolnih točaka kako bi pojačali svoju aktivnost (Li C. i sur., 2020.). Postoje različite potencijalne mete za terapiju CAR T stanicama kod raka dojke, uključujući nekoliko TAA kao što su HER2, mucin1 i TEM8 (Bajgain i sur., 2018.). Postoje dokazi da su CAR T stanice koje ciljaju mezotelin (prekomjerno eksprimiran u TNBC BT-459 stanicama) učinkovitije protiv raka kada se PD-1 eliminira pomoću CRISPR/Cas9 (Hu i sur., 2019.). Međutim, izolacija T stanica od pacijenata, a zatim njihovo uređivanje ex vivo, je radno intenzivan i dugotrajan proces. Iako univerzalne T stanice mogu smanjiti zahtjeve za izolacijom, donorske T stanice koje eksprimiraju humani leukocitni antigen (HLA) klase I i T stanični receptor (TCR) treba ukloniti kako bi se spriječile abnormalnosti reakcije presatka protiv domaćina (Ren i sur., 2017., 2017a). Korištenjem CRISPR/Cas9, HDR može istovremeno eliminirati TCR i HLA te izbaciti gen koji kodira CAR. Studije su pokazale da se CRISPR/Cas9 može koristiti za uvođenje anti-CD19 CAR-ova u TCR lokus, čime se učinkovito proizvode CAR-ovi bez iscrpljivanja T stanica (Dimitri i sur., 2022.). Razvijene su multipleks tehnologije za generiranje alogenih CAR T stanica istovremenim uklanjanjem TCR-a, beta-2-mikroglobulina (B2M), HLA-I podjedinice i drugih proteina poput PD-1 i CTLA-4, koji mogu imati veća antikancerogena svojstva protiv TNBC-a (Eyquem i sur., 2017.; Liu i sur., 2017.; Ren i sur., 2017b; Dimitri i sur., 2022.).
Korištenje CRISPR/Cas9 moglo bi poboljšati učinkovitost CAR-T stanica. Poznato je da adenozin ima imunosupresivna svojstva i može smanjiti antitumorski imunitet blokiranjem funkcije T stanica i aktiviranjem adenozinskih A2A receptora (A2AR) (Vigano i sur., 2019.). Utišavanje A2AR pomoću CRISPR/Cas9 značajno je poboljšalo učinkovitost CAR-T stanica in vivo (Giuffrida i sur., 2021.). Poznato je da T stanice pokazuju različite fenotipske karakteristike poput stanične ekspanzije, diferencijacije, oksidativnog stresa i genomskog stresa. Probir T stanica temeljen na CRISPR/Cas9 otkrio je poremećaj 25 različitih kinaza receptora T stanica. Među njima, pokazano je da delecija p38 kinaze pojačava antitumorsku aktivnost T stanica, što ukazuje na to da je p38 kinaza ključni regulator regulacije CAR-T stanica (Gurusamy i sur., 2020.).
T stanice mogu se genetski modificirati pomoću CRISPR/Cas9 kako bi se proizvele visoko eksprimirane TCR-ove. Prijenos genetski modificiranih T stanica pacijentima pokazao je jaču antikancerogenu aktivnost od endogenih T stanica. Stoga se endogeni TCR-ovi mogu natjecati s genetski promijenjenim TCR-ima kod pacijenata, što može utjecati na potencijal imunoterapije raka. Kako bi se prevladao ovaj problem, korištenje CRISPR/Cas9 za uklanjanje endogenog TCR-β u stanicama primatelja i naknadni prijenos TCR-β T stanica pacijentima oboljelima od raka može pokazati bolje imunološke odgovore protiv raka bez potrebe za endogenom spolnom konkurencijom TCR-a (Fan i sur. 2018.). Dakle, s izuzetkom CRISPR-modificiranih T stanica, TCR-i su tisuću puta osjetljiviji na tumorske antigene od normalnih TCR-transduciranih T stanica. Osim toga, kod različitih leukemija, promijenjene T stanice generirane γδ TCR+ CRISPR-om pokazuju veću ekspresiju CD4+ i CD8+ T stanica od standardnog prijenosa TCR-a (Legut i sur., 2018.). Dakle, modificirane T stanice generirane CRISPR/Cas9 tehnologijom mogle bi biti učinkovita metoda imunoterapije za prevladavanje TNBC-a.
Integrini su molekule stanične adhezije koje su prisutne u staničnim transmembranama i potiču vezanje stanica na izvanstanični matriks (ECM) (Hamidi i Ivaska, 2018.). Disregulacija integrina povezana je s razvojem i migracijom raka promjenom izvanstaničnog matriksa, što dovodi do preživljavanja stanica raka u cirkulaciji (Hamidi i Ivaska, 2018.). CRISPR/Cas9-posredovano smanjenje integrina usporava napredovanje tumora, metastaze i kolonizaciju u TNBC-u. Izviješteno je da smanjenje integrina a5 (ITGA5) smanjuje migraciju i napredovanje stanica u drugim vrstama raka, poput raka pluća (Ju i sur., 2017.), što sugerira da bi integrin a5 također mogao biti ključni čimbenik u patogenezi TNBC-a.
Generiranje knockout miševa korištenjem tradicionalnih metoda embrionalnih matičnih (ES) stanica je radno intenzivan, dugotrajan i neučinkovit proces. Potrebni su mjeseci i godine za ciljanje ES stanica homolognom rekombinacijom, uzgoj himernih miševa, a zatim njihovo križanje s heterozigotnim miševima kako bi se proizvelo homozigotno potomstvo. Za stvaranje miševa s višestrukim genetskim mutacijama potrebno je složeno križanje. Međutim, mnogi problemi pojavili su se pri korištenju miševa generiranih ablacijom ES stanica pomoću CRISPR/Cas9 ili mikroinjektiranjem CRISPR/Cas9 komponenti u oplođena jajašca s jednom stanicom. Na primjer, uvođenje promjena često se događa na bialelnim lokusima i nije genski specifično. Nedavno je objavljeno da ES stanice korištenjem CRISPR/Cas9 tehnologije mogu istovremeno umetnuti bialelne mutacije u do 5 gena (Nishizono i sur., 2021.). U tu svrhu, Cas9 mRNA i pet genski specifičnih gRNA istovremeno su transfektirane u ES stanice. Ovo naglašava obećanje i učinkovitost ovog postupka, iako su se te mutacije mogle prenijeti kada su osnivačke linije uzgajane kako bi se dobili miševi s peterostrukim knockoutom. Studija također izvještava o iznenađujućem otkriću: ES stanice više nisu potrebne za stvaranje genetski modificiranih miševa. Umjesto toga, kako bi se uklonili specifični genski produkti, Cas9 mRNA i gRNA injektirane su u embrije u stadiju jedne stanice. Kao rezultat toga, stvorene su osnivačke linije s knockoutom koje se teoretski mogu koristiti za proučavanje posljedica delecije gena kod miševa (Qin i sur., 2016.). Dakle, CRISPR/Cas9 omogućuje stvaranje transgeničnih miševa za liječenje TNBC-a po nižoj cijeni od tradicionalnog genetskog inženjeringa. Korištenjem CRISPR/Cas sustava razvijen je novi model knockout miša koji može uspješno uvesti točkaste mutacije u jednom ili više endogenih gena u TNBC-u. Na temelju ovog koncepta, životinjski modeli TNBC-a također se mogu razviti korištenjem CRISPR/Cas9-posredovane delecije BRCA1 i p53, što rezultira gubitkom popravka HR-a, genomskom nestabilnošću i mutantnim fenotipovima (Annunziato i sur., 2020.).
Trenutno se za dijagnosticiranje TNBC-a koriste različite metode poput mamografije, magnetske rezonancije (MRI) i ultrazvuka. Međutim, ove metode imaju neka ograničenja. Mamografija se koristi za dijagnosticiranje lokalnog tkiva dojke, a ne metastaza, gdje su stanice raka migrirale u druge organe. Ultrasonografija nije pouzdana metoda za dijagnosticiranje TNBC-a (Chen i Lee-Felker, 2023.). MRI ima veću osjetljivost od ultrazvuka i mamografije, ali je njezina dijagnostička točnost ograničena (Sha i Chen, 2022.). Biopsija tkiva invazivan je način identifikacije stanica raka. Međutim, u nekim slučajevima, biopsija može propustiti kancerogeno tkivo ako igla skrene s područja interesa. Osim toga, vrlo je skupa i može biti traumatična za pacijenta. TNBC je heterogena vrsta raka, pa biopsija možda neće pružiti dovoljno informacija o vrsti raka. Stoga je hitno potrebna nova dijagnostički pouzdana metoda za otkrivanje TNBC-a. CRISPR/Cas9 može poslužiti kao vrlo osjetljiva i minimalno invazivna alternativa za dijagnozu raka dojke. U tu svrhu, strategije temeljene na CRISPR/Cas9 mogu se koristiti za poboljšanje PCR metoda za dijagnosticiranje TNBC-a. Prvo, proteini Cas9 i cpf1 CRISPR sustava koriste se za uklanjanje nespecifične DNA, a zatim ta dva proteina (Cas9 i cpf1) mogu prepoznati PAM sekvencu prije vezanja na ciljnu DNA (Deepak Singh i sur., 2021.). Dakle, PCR može identificirati mutacije povezane s razvojem raka. Nekoliko studija usvojilo je ovu strategiju temeljenu na CRISPR-u za otkrivanje različitih mutacija u različitim vrstama raka (Safari i sur., 2019.). Dakle, PCR metode temeljene na CRISPR-u mogu smanjiti ovisnost dijagnoze TNBC-a o invazivnim metodama poput imunohistokemije temeljene na biopsiji.
Genotipske promjene u regulaciji hormonskih receptora također su dokazane kod TNBC-a (Chen i Russo, 2009.). PCR strategije temeljene na CRISPR/Cas9 koje koriste mikročipove za dijagnostiku na mjestu pružanja zdravstvene zaštite mogu učinkovito pratiti ove mutacije (Hajian i sur., 2019.). Također bi mogle pružiti zdravstvenim djelatnicima relevantne informacije o specifičnim mutacijama kod pacijenata s TNBC-om, što bi moglo pomoći u poboljšanju tijeka njihovog liječenja. Međutim, ova kombinirana tehnika ima ograničenja. Stoga su potrebni opsežni istraživački napori prije nego što se ova CRISPR/Cas-PCR metoda može koristiti u zdravstvu za dijagnozu TNBC-a (Yang i sur., 2019.).
Vrijeme objave: 14. listopada 2024.